JOVANA KAROLINE DE LIMA

ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO ENTRE BUTIRILCOLINESTERASE E SÍNDROME METABÓLICA

CURITIBA 2013

JOVANA KAROLINE DE LIMA

ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO ENTRE BUTIRILCOLINESTERASE E SÍNDROME METABÓLICA

Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre. Orientadora: Profª Drª Lupe Furtado-Alle

CURITIBA 2013

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“Se soubermos que um obstáculo é intransponível, deixa de ser um obstáculo para se tornar um ponto de partida”. (József Eotvos)

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RESUMO

A Síndrome Metabólica (SM) consiste da combinação de distúrbios metabólicos que predispõem ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares e diabetes do tipo 2. A butirilcolinesterase (BChE), uma esterase sérica codificada pelo gene BCHE (3q26.1) já foi associada a fatores considerados de risco para o desenvolvimento de SM, como obesidade, níveis de colesterol e diabetes. Foram genotipados os SNPs 116 (G/A rs1126680) e 1914 (A/G rs3495) do gene BCHE, mensurada a atividade enzimática, utilizando propioniltiocolina como substrato a 25 oC; analisadas as isoformas da BChE (G1, G1-alb, G2 e G4) e fenotipado o produto do loco CHE2, para relacionar com variáveis antropométricas e bioquímicas em amostra populacional de 290 indivíduos de Curitiba/PR Brasil. O alelo 1914G foi encontrado com maior frequência no grupo de obesos que em não obesos, sendo associado, portanto, a um maior IMC. Esteve também associado a menor atividade enzimática em relação aos homozigotos 1914AA. Esta menor atividade pode causar um desbalanço no metabolismo de lipídeos, podendo assim aumentar a predisposição à obesidade e diminuir a habilidade da BChE em auxiliar na manutenção da homeostase. Diferenças observadas entre os gêneros foram expressivas: homens apresentaram atividades superiores às mulheres quanto à atividade total (AT) e atividade relativa (AR) de G1, G1-alb e G2. Portadores do fenótipo CHE2 C5+ apresentaram AT e AR de todas as formas moleculares analisadas superiores que em indivíduos CHE2 C5-. Foram observadas correlações positivas da atividade total da BChE com IMC, colesterol total, LDL, triglicerídeos e glicemia, e correlação negativa com HDL. Obesos apresentaram maior AT e atividade relativa de G4, indicando que a enzima tem relação com variáveis presentes na SM. Dessa forma pode-se considerar a atividade da BChE um marcador secundário de riscos associados à SM, ressaltando que devem ser consideradas diferenças devido ao gênero e ao fenótipo do loco CHE2. Palavras-chave: Butirilcolinesterase, Obesidade, Atividade da BChE, Índice de Massa Corporal, Metabolismo de Lipídeos.

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ABSTRACT

Metabolic syndrome (MS) is a combination of metabolic disorders that predispose to cardiovascular disease and type 2 diabetes. The butyrylcholinesterase (BChE), a serum esterase encoded by the gene BCHE (3q26.1), had been associated to risk factors for developing MS, as obesity, diabetes and cholesterol levels. Two SNPs of BCHE gene were genotyped: SNPs -116 (G/A rs1126680) and 1914 (A/G rs3495). The enzyme activity was measured using propioniltiocolina as substrate; the isoforms of BChE (G1, G1-alb, G2 and G4) were analyzed, and loco CHE2 product was phenotyped. All these BChE variables were analyzed along with anthropometric and biochemical variables in a populational sample of 290 individuals from Curitiba/ PR Brazil. The 1914G allele was found with higher frequency in the obese group than in non-obese, and it was, therefore, associated with a higher BMI. It was also associated with lower enzyme activity compared to homozygous 1914AA. This lower activity may cause an imbalance in lipid metabolism and can thus increase the predisposition to obesity and decrease the ability of BChE to maintain homeostasis. Differences between genders were expressive: men showed higher activity than women in total activity (TA), relative activity (RA) of G1, G2 and G1-alb. CHE2 C5+ individuals presented TA and RA of all molecular forms analyzed higher than CHE2 C5-. Total activity of BChE was positively correlated with BMI, total cholesterol, LDL, triglycerides and glucose levels, and negatively with HDL. Obese subjects showed greater TA and RA of G4, indicating that the enzyme activity is related with variables present in the MS, and thus can be considered as a secondary marker of risks associated with MS, highlighting differences that must be considered due to gender and to phenotype of CHE2 loco. Keywords: Butyrylcholinesterase, Obesity, BChE activity, Body Mass Index, Lipid Metabolism

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 08 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................................

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2.1 A Síndrome metabólica..................................................................................... 10 2.2 BCHE................................................................................................................ 13 2.2.1 Butirilcolinesterase (BChE) e função.............................................................

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2.2.2 Formas moleculares da BChE....................................................................... 14 2.2.3 Gene BCHE...................................................................................................

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2.2.4 Região regulatória do gene BCHE................................................................. 17 2.2.5 Variantes do gene BCHE: -116A e 1914G..................................................... 18 2.2.6 Loco CHE2..................................................................................................... 20 2.3 BChE e a Síndrome Metabólica........................................................................ 20 3 OBJETIVOS......................................................................................................... 22 3.1 Objetivo Geral................................................................................................... 22 3.2 Objetivos Específicos........................................................................................ 22 4 RESULTADOS....................................................................................................

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4.1 ARTIGO 1: 1914G Variant of BCHE gene associated with enzyme activity, obesity and triglycerides levels............................................................................... 23 4.2 ARTIGO 2: Butyrylcholinesterase and variables related to obesity in a population sample from southern brazil.................................................................. 31 5 DISCUSSÃO GERAL..........................................................................................

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6 CONCLUSÕES.................................................................................................... 43 7 REFERÊNCIAS...................................................................................................

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8 APÊNDICES........................................................................................................

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8.1 Resumo para o 58o Congresso Brasileiro de Genética: 1914G variant of the BCHE gene associated with enzyme activity and body mass index....................... 50

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8.2 Resumo para o XV Congresso Brasileiro de Obesidade e Síndrome Metabólica: Atividade relativa das formas moleculares da butirilcolinesterase e obesidade................................................................................................................ 51 9 ANEXOS.............................................................................................................. 52 9.1 Descrição da metodologia utilizada..................................................................

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9.1.1 Amostras........................................................................................................ 52 9.1.2 Extração do DNA...........................................................................................

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9.1.3 Genotipagem das variantes alélicas – Taqman............................................. 53 9.1.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida para a detecção das bandas G1, G1alb, G2 e G4............................................................................................................ 54 9.1.5 Medida da atividade da BChE........................................................................ 56 9.1.6 Eletroforese em gel de ágar para fenotipagem do loco CHE2....................... 57

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1 INTRODUÇÃO

A Síndrome Metabólica (SM) consiste da combinação de distúrbios metabólicos, tais como resistência à insulina, hiperlipidemia, hipertensão, obesidade, excesso de gordura visceral e baixos níveis de HDL-colesterol. Sabe-se que tais características são fatores de risco também para diabetes do tipo 2 e doenças cardiovasculares (DCV) (ALCÂNTARA et al., 2005). Não existe um único critério aceito universalmente para definir a Síndrome. Os mais aceitos são os da Organização Mundial de Saúde (OMS) e os do National Cholesterol Education Program (NCEP – ATP III). O Brasil também dispõe do seu Consenso Brasileiro sobre Síndrome Metabólica, documento referendado por diversas entidades médicas (OLIVEIRA, 2013). Como os componentes individuais também são fatores de risco independentes para o desenvolvimento de DCVs, as tentativas de se estabelecer critérios diagnósticos para esta síndrome são baseadas no princípio de que estes componentes podem agir de maneira sinérgica ou aditiva amplificando esse risco (ATHANASSIOU, 2008). Tal imprecisão quanto à sua definição se justifica pelo fato de que estudos sobre mecanismos fisiopatológicos e riscos cardiovasculares, bem como as tentativas de definição, serem recentes e ainda restarem muitas dúvidas e indefinições sobre o assunto. A definição mais utilizada é a do NCEP -ATP III, pois seus critérios são os de mais fácil aplicação clínica (KASSI et al., 2011). A prevalência de doenças crônicas não-transmissíveis está aumentando em proporções preocupantes. Cerca de 18 milhões de pessoas morrem por ano em decorrência de DCV, cujos maiores fatores de predisposição são diabetes e hipertensão, que por sua vez estão fortemente relacionados ao excesso de peso e obesidade. Nos últimos 20 anos, as taxas de obesidade triplicaram nos países em desenvolvimento, e hoje, mais de 1,1 bilhão de adultos no mundo estão com sobrepeso, dos quais 312 milhões são obesos (HOSSAIN, KAWAR e NAHAS, 2007). Diante da preocupação com a alta prevalência mundial da obesidade (e suas consequências), o estudo da SM tornou-se um tópico de discussão científica, sendo considerado também um dos grandes desafios da medicina contemporânea. A butirilcolinesterase humana (BChE) é uma colinesterase não específica que hidrolisa diferentes ésteres de colina. A BChE é sintetizada pelas células hepáticas e

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então difundida para outras partes do corpo (WESCOE et al., 1947). Chatonnet e Lockridge (1989) afirmam que a BChE é também sintetizada no cérebro e Oreskovic e Kunec-Vaji (1992) demonstraram que em murinos, ela também é sintetizada nas células do tecido adiposo. A enzima é codificada pelo gene BCHE (3q26.1), que apresenta quatro éxons (ARPAGAUS et al., 1990) com mais de 70 variantes já descritas, sendo a maioria rara (JACKOWSKI, 2009). Vários fatores metabólicos foram associados com alterações na atividade da BChE, como por exemplo, a síntese de estrógenos durante a gravidez (correlacionados negativamente com a atividade da BChE) (SHNIDER, 1965), peso (Souza et al., 2005), índice de massa corporal (ALCÂNTARA et al., 2005), obesidade (FURTADO-ALLE et al., 2008) e diabetes do tipo 2 (SRIDHAR et al., 2005) (correlacionados positivamente com a atividade da BChE). A correlação de anormalidades lipídicas com obesidade, diabetes, e SM pode implicar no envolvimento da BChE. Randell et al. (2005) verificaram que a atividade da BChE plasmática foi significativamente maior em pacientes com fatores de risco de SM, que indivíduos controle no Canadá. Entretanto, o significado funcional da alta atividade da BChE ainda não é conhecido. Benyamin et al. (2011) investigaram as causas genéticas da variação na atividade da BChE e também as causas das covariações com marcadores de risco de SM. Os autores demonstraram que a atividade da BChE está relacionada significativamente com IMC (índice de massa corporal), HDL e LDL-colesterol, triglicerídeos, glicose, insulina, proteína C-reativa, sugerindo que essa relação é decorrente de causas multifatoriais (tendo também efeitos, por exemplo, dos produtos dos genes RAPH1-ABI2, RNPEP, UGT1A1 e influenciado por fatores ambientais). Diante dos múltiplos aspectos que estão envolvidos no desenvolvimento de SM, vem se percebendo o papel fundamental da genética, esse estudo visa investigar a associação entre as mutações -116A e 1914G do gene BCHE, atividade total da BChE e atividade relativa das formas moleculares, bem como fenotipagem do loco CHE2, com variáveis antropométricas e bioquímicas relacionadas a risco de SM.

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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 SÍNDROME METABÓLICA

Desde aproximadamente a segunda metade do século XX ocorreram profundas mudanças nos padrões socioeconômicos e culturais que acarretaram grandes transformações no estilo de vida das pessoas no mundo como um todo. Essas transformações foram significativas no sentido de exercer influência no aumento e melhoria da expectativa de vida das pessoas, mas também influenciaram em alguns aspectos na qualidade de vida de forma negativa, através de alterações, por exemplo, nos hábitos alimentares e no gasto energético relacionado às atividades diárias, bem como o estresse, em grande parte causado pela vida urbana e moderna. Tais fatores têm contribuído para o aumento da incidência de várias doenças crônicas, como a obesidade, o diabetes e a hipertensão arterial, que frequentemente estão relacionados a alterações nos níveis de lipoproteínas plasmáticas e risco aumentado de doenças cardiovasculares (BURKE e BELL, 2000). A Síndrome Metabólica (SM) é um termo estabelecido no final da década de 1990 pela Organização Mundial da Saúde (OMS), que reúne fatores de risco para doenças cardiovasculares (DCV), entre eles a hipertensão, intolerância à glicose/ diabetes do tipo 2, altos níveis de triglicerídeos e dislipidemia (LDL-colesterol alto, triglicérides alto e HDL-colesterol baixo) (WHO, 1999). Outras anormalidades metabólicas também tem sido associadas à síndrome, tais como: obesidade (principalmente abdominal), estados pró-inflamatórios e pró-trombóticos. A falta de consenso sobre os critérios aceitos para definir a síndrome, dificulta vários estudos sobre prevalência da SM. Em 2001, o “Third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults” (NCEP-ATPIII) definiu critérios clínicos e laboratoriais para o diagnóstico de SM (GRUNDY et al., 2004), que foi mais viável de se estudar clínica e cientificamente. Segundo o NCEP-ATPIII, a SM representa a combinação de pelo menos três componentes apresentados na tabela 1.

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A “epidemia da obesidade” é apontada como o principal responsável pelo aumento na prevalência de SM, dessa forma, esta seria uma potencial candidata à etiologia principal da síndrome em questão. Grundy et al. (2004) definem a síndrome metabólica essencialmente como um agrupamento de complicações metabólicas decorrentes da obesidade. A obesidade, especialmente com acúmulo de gordura abdominal, pode produzir hormônios e outras substâncias que causam sérios problemas tais como, resistência à insulina, hipertensão, dislipidemias. Sabe-se que adipócitos possuem importante função, envolvendo vias inflamatórias, trombóticas, sensibilidade à insulina, além da habilidade para produzir e secretar hormônios específicos que regulam a homeostase energética (STEPHENS, 2012). Outra consequência do excesso de gordura abdominal é a presença de níveis elevados de ácidos graxos não esterificados, que podem sobrecarregar o fígado e os músculos, e predispor a resistência à insulina. Há evidências de que também elevem níveis de PAI-1 (inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1), o qual contribui diretamente nas complicações da obesidade, podendo inclusive, influenciar no acúmulo de gordura visceral (BARBATO et al., 2009). Tabela 1 – Identificação clínica da síndrome metabólica Componentes

Níveis

Obesidade abdominal (circunferência) Homens

> 102 cm

Mulheres

> 88 cm

Triglicerídeos

≥ 150 mg/dL

HDL Colesterol Homens

< 40 mg/dL

Mulheres

< 50 mg/dL

Pressão arterial

≥ 130/85 mmHg

Glicemia de jejum

≥110 mg/dL

Fonte: NCEP-ATPIII (GRUNDY et al., 2002).

A resistência à insulina também possui um papel central na etiologia de SM, por esta razão, entre outros nomes que a síndrome já teve, um deles foi “síndrome da resistência à insulina”. A síndrome metabólica já foi questionada cientificamente quanto a fato de consistir mesmo uma doença ou não. Entretanto, após diversos

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estudos apontarem que múltiplos fatores de risco co-ocorrem em maior grau do que seria esperado ao acaso (MEIGS, 2002), é consenso considerar a coexistência de três ou mais dos sintomas listados, como característicos da síndrome em questão. Restam ainda na literatura, debates sobre os fatores que estão incluídos na SM, bem como os níveis dos parâmetros incluídos que são toleráveis (BRANDÃO, et al., 2005). As observações de que a síndrome metabólica apresenta prevalência elevada e crescente com o incremento da faixa etária são aspectos preocupantes, considerando o envelhecimento marcante da população em diferentes países (MEIGS, 2002). Ford (2003) estudando a prevalência de SM nos Estados Unidos, de acordo com os critérios da definição da NCEP-ATPIII, em amostra com idade superior ou igual a 20 anos, obteve a prevalência de 23,9%, e destacou em seu trabalho que a prevalência varia de acordo com a definição utilizada e com a população estudada, bem como seu grupo étnico. Ervin (2009) posteriormente, também nos Estados Unidos, e sob os mesmos critérios, estimou uma prevalência de 34% de SM em amostra populacional. Salaroli et al. (2007), utilizando também os mesmos critérios diagnósticos, obtiveram prevalência de 29,8% para a população de Vitória/ ES, Brasil. Nesse estudo foi constatado um aumento progressivo na prevalência de acordo com a idade (25 a 34 anos – 15,8%, enquanto que entre 55 e 64 anos a prevalência foi de 48,3%). Estudos anteriores (DALLONGEVILLE et al., 2005) com o objetivo de verificar a relação entre renda familiar e SM, evidenciaram que a renda familiar está em geral associada inversamente com a SM em mulheres, mas não em homens, concordando com o estudo de Salaroli et al. (2007). Determinantes sociais são fortemente correlacionados com a SM, porém os motivos desta relação não estão totalmente elucidados. Existem outros estudos sobre prevalência de SM no Brasil, mas os critérios diagnósticos variam, e geralmente a amostra é estratificada, não representando a população.

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2.2 BCHE

2.2.1 Butirilcolinesterase (BChE) e função

As colinesterases (ChEs) são enzimas que desempenham papel chave na neurotransmissão colinérgica. Existem dois tipos de colinesterases nos vertebrados: acetilcolinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) e butirilcolinesterase (BChE, EC 3.1.1.8). A acetilcolinesterase é responsável por catalisar a hidrólise do neurotransmissor acetilcolina na membrana pós-sináptica na junção neuromuscular, originando acetato e colina. É encontrada também em eritrócitos e no sistema nervoso. A BChE é produzida no fígado, e distribuída amplamente no organismo, sendo um dos componentes do plasma, fígado, coração, pâncreas, endotélio vascular, pele, cérebro, músculo liso e adipócitos (CHATONNET e LOCKDRIDGE, 1989). Embora as duas enzimas apresentem formas moleculares com certa semelhança estrutural, incluindo monômeros, dímeros, tetrâmeros e oligômeros complexos, elas diferem em especificidade e sensibilidade inibitória (LOCKRIDGE et al., 1987). Embora permaneçam desconhecidos a função fisiológica e o substrato natural da BChE, sabe-se que ela é capaz de hidrolizar diversos ésteres de colina, desde a acetilcolina até heptanoilcolina, sendo mais eficiente na hidrólise de butirilcolina. Anteriormente chamada de pseudocolinesterase, colinesterase do soro e colinesterase não específica, a BChE foi estudada e associada a diversos processos biológicos. Um deles, de grande importância é o seu papel em mecanismos farmacológicos e toxicológicos. Alguns compostos que podem ser desintoxicados fisiologicamente pela BChE são: succinilcolina; organofosfatos e carbamatos; cocaína; amitriptilina; drogas anticonvulsivas e aspirina (ÇOKUĞRAŞ, 2003). Além das funções colinérgicas, a BChE possui papel no desenvolvimento animal, influenciando a morfogênese, movimentos morfogenéticos e também induzindo a expressão da AChE, que por sua vez estimula a diferenciação e adesão celular durante a neurogênese (ROBITZKI et al., 1997). Em humanos, a sequência de aminoácidos da BChE e da AChE tem 53% de identidade, sendo bem conservada no sítio ativo (LOCKRIDGE et al., 1987). A análise filogenética da expressão da BChE e da AChE indica que a AChE é

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ancestral das colinesterases em vertebrados, estas observações sugerem que um evento de duplicação gênica e subsequente divergência estrutural e funcional se procederam para o surgimento da BChE (CHATONNET e LOCKRIDGE, 1989). Diversos estudos têm associado a BChE com aspectos metabólicos, por exemplo, com níveis de lipídeos (BENYAMIN et al., 2011), peso (SOUZA et al., 2005), índice de massa corporal (IMC) (ALCÂNTARA et al., 2005) e obesidade (CHAUTARD-FREIRE-MAIA et al., 1991; KUTTY, 1980; FURTADO-ALLE et al., 2008). A relação entre BChE e SM será abordada mais detalhadamente no item 2.3.

2.2.2 Formas moleculares e estrutura bioquímica da BChE

No plasma, a BChE ocorre predominantemente como um tetrâmero (G4), formado por dímero de dímeros. Na formação de cada dímero, os monômeros estão ligados por pontes de dissulfeto e, ao formar o tetrâmero, os dímeros ligam-se entre si por ligações não covalentes. Outras formas moleculares, como monômeros (G1) e dímeros (G2), também estão presentes no plasma em menores proporções. Os monômeros são constituídos de 574 aminoácidos e nove cadeias de carboidratos, com peso molecular aproximado de 85 kDa (LOCKRIDGE et al., 1987). Existe uma nomenclatura anterior relativa às formas moleculares de BChE, baseada na mobilidade eletroforética, proposta por Harris, Hopkinson e Robson (1962) que encontraram quatro bandas em eletroforese de gel de amido, presentes normalmente em estudos de atividade da BChE humana, chamadas de C 1 a C4 em ordem crescente de mobilidade. A forma C1 (G1) é um monômero; C2 (referida como G1-alb) consiste de uma forma heteróloga da BChE, formada pela associação de um monômero ligado à albumina (MASSON, 1989); C3 (G2) é um dímero; e C4 (G4), que é a forma mais abundante da BChE plasmática, é o tetrâmero. Nesse mesmo trabalho, os autores verificaram uma quinta banda, presente somente em alguns indivíduos, à qual denominou C5, que consiste do tetrâmero ligado a uma substância ainda desconhecida de aproximadamente 60 kDa. Nachon et al. (2002) descreveram a estrutura cristal da BChE a partir de uma BChE humana recombinante, uma vez que o homotetrâmero é altamente glicosilado e os grupamentos de açúcar, de modo geral, perturbam a cristalização. Apesar disso, os autores ressaltaram a importância desses domínios glicosilados,

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que possuem papel essencial na conformação final da proteína, e também em processos de secreção, estabilidade e solubilidade, além de proteção contra a proteólise, contribuindo para um tempo maior na circulação sanguínea. Entretanto, na BChE, os resíduos aromáticos na entrada do sítio alvo, bem como outros domínios apresentam diferenças marcantes que tornam possível a ligação de uma gama maior de substratos na BChE em relação à AChE. O sítio ativo da BChE humana é composto por aproximadamente 55 aminoácidos. O sítio aniônico periférico, localizado na região da entrada do sítio ativo, é formado pelos aminoácidos ácido aspártico (D70) e tirosina (Y332) os quais estão

envolvidos

no

mecanismo

de

ativação

de

substratos

carregados

positivamente, assim como outros domínios, por exemplo o ácido aspártico conectado ao triptofano (W82), por meio de uma alça ômega (Ω), que consiste um sub-sítio de ligação do sítio ativo (MASSON et al., 2001). Alcântara et al. (1999) em análise da BChE do plasma sob eletroforese em gel de poliacrilamida, obtiveram 12 bandas, das quais oito representam formas heterólogas nas quais a BChE se liga a outras substâncias como a albumina, a α 2macroglobulina, a transferrina e outras moléculas ainda não identificadas. Boberg et al. (2010) ao verificar que indivíduos obesos possuem atividade da BChE significativamente maior que não-obesos, como já descrito anteriormente (Alcântara et al., 2005), procuraram investigar se havia efeito das formas moleculares nesta atividade total. Os autores mensuraram então a intensidade relativa (IR) de cada banda eletroforética, referentes às formas moleculares de BChE, cujos resultados revelaram não haver diferença significativa, quanto à IR entre obesos e não-obesos. Levando assim a conclusão de que a alta atividade enzimática observada nos obesos, se deve a uma maior quantidade da BChE sob as formas moleculares em níveis proporcionais, constituindo, portanto, um mecanismo regulado especificamente, de modo a manter a IR independentemente do IMC. Silva et al. (2012) também investigaram a atividade da BChE e a RI, em adolescentes obesos antes e após 12 semanas de exercícios físicos. Os resultados permitiram concluir que a atividade dos obesos antes do programa foi maior, sendo que posteriormente ficou semelhante às de não-obesos. A IR das isoformas da BChE não

apresentaram diferenças

significativas

antes e

concordando com os resultados de Boberg et al. (2010).

depois

do

programa,

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2.2.3 Gene BCHE

Arpagaus et al. (1990) obtiveram evidências da existência de um único gene que codifica a BChE humana, bem como a estrutura deste gene. Localizado na região 3q26.1, o gene BCHE possui quatro éxons (Figura 1). 1722 pares de bases, que codificam a enzima BChE madura, que é formada por 574 resíduos de aminoácidos (NCBI, acessado em 04/03/2013).

Figura 1. Desenho esquemático do gene BCHE, mostrando os quatro éxons representados como retângulos e o número de pares de bases que os compõem. A região sombreada corresponde à sequência que codifica a proteína madura. Fonte: Parnas et al, 2011.

O éxon 1 (149 pb) contém sequências não traduzidas, e dois potenciais sítios de início de tradução nos códons -69 e -47. O éxon 2 (1.525 pb) contém 83% da sequência codificadora da proteína madura, incluindo a extremidade N-terminal. O primeiro códon que codifica para o peptídeo maduro está localizado no éxon 2. O éxon 3 contém 167 pb. O éxon 4 (604 pb) codifica a extremidade C-terminal da proteína e apresenta a região 3’ não traduzida que possui dois sinais de poliadenilação (NCBI, acessado em 04/03/2013). A região que codifica a proteína madura abrange grande parte do éxon 2, todo o éxon 3 e parte do éxon 4, conforme mostrado na figura 1. O mRNA da BChE humana possui 40% de C+G, que é, aproximadamente, a proporção dessas bases no genoma humano. Quando comparados com o índice de nucleotídeos C+G que codificam proteínas colinérgicas de mamíferos e aves (BChE, AChE,

receptores

nicotínicos

e

muscarínicos

de

acetilcolina

e

colina

acetiltransferase) observa-se que o gene da BChE possui um conteúdo menor de C+G em relação a outras proteínas colinérgicas. O conteúdo de C+G pode ser importante para a regulação ao nível transcricional (CHATONNET e LOCKRIDGE, 1989). O mRNA da BChE é mais abundante na maioria dos tecidos que o da AChE, exceto no cérebro e músculo onde o mRNA da AChE é mais abundante (LEGAY et al., 1993). No estudo de Jbilo et al. (1994) foram mensuradas as quantidades relativas de mRNA da BChE em tecidos humanos. Apresentaram maiores

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proporções de mRNA, respectivamente, os seguintes órgãos: fígado> pulmão> cérebro> coração> músculo esquelético> pâncreas.

2.2.4 Região regulatória do gene BCHE

Jbilo et al. (1994) caracterizaram a região promotora e sítios de início de transcrição da BCHE humana. Foi identificado a montante da região codificadora, o sítio de início de transcrição da BCHE, com 2500 pb. Eles não encontraram as sequências consensos CAAT e TATA boxes, entretanto identificaram uma região de homologia a sítios de início de transcrição encontrados em outros genes sem TATA box. Essa região é rica em pirimidinas e possui um sítio de ligação para AP1 (fator de transcrição), sítios para Oct-1 (proteína ligadora ao octâmero), PEA3 (elementos que contêm sequências similares ao sítio de ligação da classe ETS de oncoproteínas) e sítios de ligação de topoisomerase. O sítio de ligação ao AP1 está localizado a 71 pb a montante do sítio de início da transcrição, incluído em um fragmento de 200 pb, que é definido como promotor mínimo do gene BCHE humano (JBILO et al., 1994). Proteínas AP1 são frequentemente o alvo final de cascatas de quinases transdutoras de sinal, tornandose ativas quando fosforiladas, ativando promotores e levando à expressão dos genes correspondentes (CAVIGELLI et al., 1995). Muitos genes de mamíferos que possuem sua expressão regulada durante o desenvolvimento, contêm sítios de ligação ao PEA3 nas suas regiões regulatórias. Os motivos PEA3 e AP1 podem funcionar sinergicamente para a ativação da transcrição (WASYLYK et al., 1990). O sítio de ligação ao Oct-1, identificado na região regulatória da BCHE humana, constitui um octâmero de nucleotídeos (ATTTGCAT), ao qual Oct-1 reconhece. Oct-1 é membro da família POU de fatores de transcrição (TF) (JBILO et al., 1994). Na literatura, os membros da família POU de TF são conhecidos geralmente como fatores de transcrição necessários para expressão de genes de imunoglobulinas (Ig) nas células B, genes da histona H2B, reguladas de acordo com a fase do ciclo celular; e também para transcrição constitutiva de RNA nuclear pequeno (snRNA), que pode ser realizado pela RNA polimerase II ou III (KRAPP e STRUBIN, 1999). A capacidade da Oct-1 ativar diferencialmente a transcrição de

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alguns genes é explicada pelo fato de ela interagir com proteínas de células específicas e com proteínas ubíquas específicas, que funcionam como fator de seletividade na expressão (HERR e CLEARY, 1995). Oct-1 é constituída de dois subdomínios estruturais, POU-S e POU-H, que se ligam diretamente ao DNA, ambos possuindo motivo estrutural hélice-volta-hélice, independentes entre si, e ligados por uma ponte altamente flexível. Tal flexibilidade permite que Oct-1 adote diferentes conformações de acordo com os diferentes sítios de ligação ao DNA (CLEARY e HERR, 1995). Oct-1 pode exercer múltiplas funções durante o desenvolvimento e também no adulto. Existem evidências de que os fatores de transcrição da família POU desempenham papel na inibição e promoção da proliferação celular, e na determinação de linhagens celulares, bem como na migração, sobrevivência e na diferenciação das células (ANDERSEN e ROSENFELD, 2001). O sítio de ligação da topoisomerase II ao DNA também foi reconhecido no estudo de Jbilo et al. (1994). Tal enzima desempenha papel essencial na replicação, aliviando a tensão produzida pela abertura da forquilha de replicação, através da produção de cortes em ambas as fitas de DNA, introduzindo ou retirando espiras conforme a necessidade da célula, de acordo com a fase do ciclo celular. A região 3’UTR do gene BCHE também foi relacionada a regulação da expressão através de MicroRNAs (miRs). Hanin e Soreq (2011) sugeriram que a região 3’UTR é alvo de pelo menos 116 miRs que podem estar agindo como silenciadores do mRNA de BCHE. Neste mesmo estudo foi relatado que a resposta de BCHE a glicocorticóides é especialmente influenciada por miRs. Sabe-se que os glicocorticóides possuem efeito na gliconeogênese, hiperglicemia, lipólise e distribuição da gordura corporal (PECKETT et al., 2011). Deste modo, é possível que polimorfismos do gene, influenciem na afinidade destes MiRs levando a alterações em respostas metabólicas envolvidas em tais processos.

2.2.5 Variantes do gene BCHE: -116A e 1914G

A primeira variante genética do gene BCHE foi descoberta após o uso de succinilcolina, que consiste de um bloqueador neuromuscular despolarizante, administrado em procedimentos de anestesia, atuando como relaxante muscular (KALOW e GENEST, 1957). Alguns indivíduos que possuem uma determinada

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variante da BChE são incapazes de hidrolizar a succinilcolina, o que acarreta apnéia respiratória e paralisia muscular, quando submetidos a tratamentos com a dose fisiológica padrão (HARRIS e WHITTAKER, 1961). Atualmente, diversas variantes já foram identificadas para o gene BCHE. Uma das mais frequentes é a mutação de ponto no nucleotídeo 1615 (GCA → ACA; A539T), no éxon 4, que resulta em uma substituição no códon 539 (Ala-Thr539), a enzima resultante é conhecida como “variante K”. Esta variante foi descrita pela primeira vez no trabalho de Rubinstein, Dietz e Lubrano (1978), que constataram que a variante era encontrada numa quantidade 33% menor na circulação, quando comparada à enzima usual. Altamirano, Bartels e Lockridge (2000) verificaram que não houve diferença na afinidade enzimática, taxa de catálise de substratos, taxa de secreção da célula e formação de tetrâmeros, quando comparadas a variante K e a enzima usual, propondo então que a alteração nos níveis de BChE circulante causados pela variante K, poderia estar associada a variação na região regulatória ou promotora do gene. Na região não codificadora do gene BCHE no éxon 1 existe um sítio polimórfico no nucleotídeo -116 (TGC/TAC), conhecido como variante -116A com frequência de cerca de 8% em população norte-americana (BARTELS et al., 1990) e euro-brasileira (FURTADO-ALLE et al., 2008). Foi constatado que a variante -116A é preferencialmente encontrada em combinação cis com a 1615A (BARTELS et al., 1990). Furtado-Alle et al. (2008) propuseram que a baixa atividade antes atribuída à presença da mutação 1615A deve-se a presença conjunta da 1615A com -116A, pois quando apenas a mutação 1615A está presente, não há alteração na atividade da BChE. Os autores sugerem que a mutação -116A interfere na ligação de elementos reguladores na transcrição e/ ou tradução do gene BCHE, já que a região 5’ UTR do mRNA inclui a região -116. Bartels et al., (1990) descreveram um polimorfismo na região 1914 (A/G) da BCHE, no éxon 4. Similarmente à -116A, é encontrada em região não codificadora (189 nucleotídeos após o códon de parada de tradução). Este polimorfismo apresenta desequilíbrio de ligação com a variante -116A e também com a 1615A, exibindo configuração cis com estas. Esses dados sugerem que a diminuição da atividade enzimática da BChE pode ser atribuída à interação entre variantes e não apenas a um único polimorfismo dos que estão presentes.

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2.2.6 Loco CHE2

Além de apresentar formas diversas, devido às variantes codificadas pelo gene BCHE, a variabilidade da enzima BChE pode ser influenciada pelo loco CHE2 (2q33-q35). Em eletroforese bidimensional de gel de amido, além das bandas C1 a C4, Harris, Hopkinson e Robson (1962) encontraram uma banda que foi denominada C5. Essa banda foi encontrada em apenas 4,6% da amostra e o gene responsável pela sua determinação foi chamado CHE2, apresentando os alelos CHE2*C5+ e CHE2*C5– responsáveis, respectivamente, pela presença e pela ausência da banda C5. Chautard-Freire-Maia et al. (1991) encontraram, em amostra da população de Curitiba/ PR, o fenótipo CHE2 C5+ com frequência de 10,3%, sendo que esses indivíduos apresentam atividade enzimática da BChE cerca de 30% superior a de indivíduos CHE2 C5−. O

loco

CHE2

codifica

uma

substância

cuja

natureza

permanece

desconhecida, que se liga à enzima, sendo responsável pelo surgimento da forma heteróloga da BChE, evidenciada pela banda eletroforética C5, a qual Masson (2001) sugeriu que seja formada pelo tetrâmero G4 associado com outra proteína ainda desconhecida; e apesar dos resultados obtidos nesse estudo não permitirem identificar a

substância codificada pelo loco CHE2, várias hipóteses (albumina,

imunoglobulina, híbrido de AChE/BChE, colágeno, fibronectina e fosfolipídeo) puderam ser descartadas. Li et al. (2008) identificaram o gene RAPH1 (Rasassociated and PH domains, que codifica a lamelipodina) como um bom candidato para produzir esta substância que se liga a BChE na forma C5. Os indivíduos CHE2 C5+ são menos sensíveis à succinilcolina, ou seja, a duração do efeito da droga é menor que os indivíduos CHE2 C5– (SUGIMORI, 1986). Alcântara et al. (2001) analisando dados dos fenótipos C5, demonstraram que a média de IMC de CHE2 C5+ é menor que CHE2 C5-, o que sugere a influência do loco CHE2 no metabolismo de lipídeos.

2.3 BChE e a Síndrome Metabólica

Muitos estudos associaram determinados polimorfismos genéticos aos componentes de fatores de risco da síndrome metabólica. Os genes que podem

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estar envolvidos na etiologia da SM podem estar relacionados à secreção de insulina (ex: glucoquinase) e regulação do metabolismo de carboidratos e gorduras (ZIMMET et al., 1999). A atividade da BChE mostrou-se correlacionada positivamente com peso e negativamente com altura, indicando aí sua correlação com o índice de massa corporal (CHAUTARD-FREIRE-MAIA et al., 1991). Alcântara (2000) verificou uma maior frequência de bandas extras da BChE em obesos do que na população geral, sugerindo um papel do gene BCHE na determinação genética da obesidade. Segundo Souza et al. (2005), a BCHE pode estar relacionada com o metabolismo de lipídeos, uma vez que variantes do nucleotídeo 1615 do gene BCHE afetam diferentemente a variância do IMC. Furtado-Alle et al. (2008) investigando a associação do IMC com variantes do nucleotídeo -116, no qual a mutação -116A se apresenta preferencialmente em conformação cis com a 1615A demonstraram que a mutação está associada a um menor IMC e menor atividade da BChE, sendo que essa diminuição anteriormente atribuída somente a variante K (A539T), ocorre devido à presença concomitante das duas mutações. A interação dos produtos dos genes BCHE, que codifica a BChE, e do loco CHE2, condicionando o fenótipo CHE2 C5+, está associado com peso e IMC mais baixos do que o fenótipo CHE2 C5- (CHAUTARD-FREIRE-MAIA et al., 1991). É esperado também que o fenótipo CHE2 C5+, determine maior atividade enzimática da BChE (ACÂNTARA et al., 2001). Benyamin et al. (2011) demonstraram correlação positiva entre atividade da BChE e SM, sendo que a correlação mais intensa foi com os fatores níveis de triglicerídeos e IMC. Boberg et al. (2010) demonstraram que indivíduos obesos possuem atividade

da

BChE

significativamente

maior

que

não-obesos,

entretanto

evidenciaram não haver diferença significativa entre IR das formas moleculares de obesos e não-obesos, sugerindo então que a regulação nos níveis específicos de cada forma molecular, pode ser importante para a função da BChE. Kálmán et al. (2004) encontraram associação positiva entre atividade da BChE plasmática e níveis de colesterol e triglicerídeos séricos, sugerindo que a expressão do gene BCHE seja regulada positivamente pela hiperlipidemia.

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3 OBJETIVO

3.1 Objetivo Geral

Realizar estudo de associação entre variáveis da BChE e SM em amostra de funcionários da Universidade Federal do Paraná (UFPR).

3.2 Objetivos específicos

1) Investigar associação entre as variantes -116A e 1914G do gene BCHE, e variáveis bioquímicas (colesterol, glicemia, triglicerídeos, HDL e LDLcolesterol), e antropométricas (IMC) relacionadas à obesidade.

2) Investigar associação entre a atividade da BChE e variáveis relacionadas à obesidade, que indicam risco de desenvolvimento de SM.

3) Investigar associação entre as formas moleculares da BChE e variáveis que relacionadas à obesidade, que indicam risco de desenvolvimento de SM.

4) Investigar associação entre os fenótipos CHE2 C5+ e CHE2 C5-, e variáveis que indicam risco de desenvolvimento de SM.

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4 RESULTADOS

Os resultados serão apresentados em dois capítulos e cada um deles na forma de artigo. O primeiro artigo relaciona variantes genotipadas dos SNPs -116 e 1914 do gene BCHE e atividade enzimática total da BChE, com variáveis antropométricas e bioquímicas. O segundo trata das diferenças bioquímicas observadas entre homens e mulheres, investiga atividades totais e relativas da BChE na amostra dividida em grupos de obesos e não obesos, grupos de homens e mulheres e de portadores do fenótipo CHE2 C5+ e CHE C5-. Correlaciona também variáveis antropométricas e bioquímicas com atividade total e relativa das formas moleculares da BChE.

4.1 ARTIGO 1: 1914G VARIANT OF BCHE GENE ASSOCIATED WITH ENZYME ACTIVITY, OBESITY AND TRIGLYCERIDES LEVELS ABSTRACT: Polymorphisms of butyrylcholinesterase (BChE) have been reported to be associated to weight, BMI variance and hypertriglyceridemia in adults and adolescents. The aim of the present study was to investigate the association of 116A (SNP: G/A; rs1126680) and 1914G (SNP: A/G; rs3495) variants of BCHE gene with anthropometric and biochemical variables associated with obesity in population sample with 115 individuals, from Southern Brazil. Participants were divided into two groups: obese (BMI ≥ 30) and non-obese (BMI < 30). The 1914G allele showed significantly higher frequency in the obese group, and carriers of 1914G allele showed lower mean BChE activity when compared to 1914A carriers (p=0.006). Higher means of BMI (p = 0.02) and triglyceride (TG; p=0.01) were found in 1914G carriers (BMI= 27.57Kg/m2; TG= 150.8mg/dL) when compared to 1914A homozigotes (BMI= 25.55 Kg/m2; TG= 107.9 mg/dL). Carriers of the -116A allele showed lower mean BChE activity than usual homozigotes, and the -116A variant was found in cis with 1914G (p