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Humberto Agostinho Pedroso Licenciado em Bioquímica

Características estruturais e mecanísticas da enzima desnitrificante Redutase do Nitrito Citocromo cd1

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Presidente de júri: Professor Doutor Pedro Miguel Calado Simões, Professor Auxiliar da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (FCT-UNL) Arguente: Doutora Smilja Todorovic, Investigadora Auxiliar do Instituto de Tecnologia Química e Biológica da Universidade Nova de Lisboa (ITQB-UNL)

Vogal: Doutora Maria Gabriela Machado de Almeida, Professora Associada do Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz

I

Características estruturais e mecanísticas da enzima desnitrificante Redutase do Nitrito Citocromo cd1 Copyright  Humberto Agostinho Pedroso, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa A Faculdade de Ciências e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa têm o direito, perpétuo e sem limites geográficos, de arquivar e publicar esta dissertação através de exemplares impressos reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser inventado, e de a divulgar através de repositórios científicos e de admitir a sua cópia e distribuição com objectivos educacionais ou de investigação, não comerciais, desde que seja dado crédito ao autor e editor.

II

A Jesuína Guilhermina de Carvalho (Avó “Laura”)

III

IV

AGRADECIMENTOS

Gostaria de expressar, nestas singelas palavras, o meu agradecimento a todas as pessoas que de alguma forma possibilitaram que pudesse desenvolver a tese que se apresenta. Em primeiro lugar, um agradecimento muito especial à Dra. Maria Gabriela Almeida por ter possibilitado a realização desta tese, sob a sua orientação e pelos conhecimentos transmitidos a todos os níveis. Ao Professor Dr. José Moura e à Professora Dra. Isabel Moura por me integrar nos seus grupos de investigação. Um agradecimento muito especial à Dra. Célia Silveira pela sua “co-orientação”, embora não formalizada, pela total disponibilidade para dúvidas e auxilio constante. Obrigado. Ao Dr. Rui Almeida por todos os conhecimentos transmitidos no campo do docking de proteínas, pela sua total disponibilidade e enorme paciência nas explicações e acompanhamento. À Dra. Susana Ramos pelos conhecimentos transmitidos em todas as vertentes científicas, amizade e paciência. Ao Dr. Stephane Besson pela sua ajuda na iniciação do conceito de docking. À Dra. Susana Andrade por me ter recebido e disponibilizado o seu laboratório na Universidade de Freiburg, Alemanha. À Anja Wüst pelo seu acompanhamento permanente (quase exaustivo). Às minhas duas colegas de gabinete/bancada, Patrícia Rodrigues e a Cláudia Nóbrega pelo acompanhamento constante nos bons e maus momentos, sem as suas loucuras esta tese não seria a mesma coisa, nem os dias passariam tão rápido sem as nossas tertúlias … bons tempos que jamais esquecerei. Ao magnífico grupo de investigação em que estive integrado neste ano, pelo seu companheirismo, auxílio laboratorial, pelos momentos de descontração proporcionados e até… por tudo mesmo, foram fantásticos.

V

E acima de tudo à minha família que fez todo o possível para que este momento chegasse. Mãe, pai e Simão, o vosso esforço, apoio, dedicação e compreensão estão gravados e já mais serão esquecidos. Tios, primos e madrinha por compreenderem as minhas ausências forçadas e apoio mais do que incondicional, muito obrigado. E a si AVÓ, a luz minha vida que, pouco antes de este momento chegar, se ofuscou (porque nunca se apagará), continua e continuará a ser a minha razão de lutar todos os dias para alcançar os meus objectivos e depois imaginar os seus olhos lindos, de avó orgulhosa do seu neto. Como teria sido tão gratificante partilhar este momento consigo, mas a sua hora chegou antes e não deu para ficar mais tempo, compreendo. Contudo eu sei que esteja onde estiver, estará muito orgulhosa do meu trabalho e eu do seu “Laurinha”. Muito, muito obrigado. Pro fim, mas não menos importantes, aos amigos, aos verdadeiros amigos que tive ao meu lado nestes momentos mais atribulados, foram um grande apoio para que tudo fosse superado. Obrigado por me aturarem nos momentos de “resmunguice”, por compreenderem as ausências, acima de tudo por serem quem verdadeiramente são. O meu muito obrigado a todos vós.

VI

RESUMO O citocromo cd1 NiR (cit. cd1) catalisa a conversão de nitrito a óxido nítrico na bactéria desnitrificante, Marinobacter hydrocarbonoclasticus. Consiste num homodímero de 120 kDa, sendo cada monómero constituído por dois domínios, um de transferência electrónica (hemo c) e outro catalítico (hemo d1). Estudos anteriores mostraram que a actividade enzimática depende de uma pré-activação estrutural desencadeada pela entrada de electrões através do seu parceiro redox fisiológico [1]. Resultados obtidos por electroquímica mediada mostraram que a velocidade da reacção enzimática depende da natureza do parceiro redox, sendo o seu doador electrónico fisiológico, o cit. c552, aquele que proporciona velocidades reaccionais mais elevadas. Com efeito, este foi o único agente redutor que permitiu observar actividade catalítica em condições saturantes de nitrito, segundo um mecanismo do tipo EC’. Nas situações em que se substituiu o cit. c552 por um mediador biológico (cit. c de coração de cavalo) ou químico (PMS, índigo carmine e fenosafranina), apenas se observou a existência de uma resposta catalítica para velocidades de varrimento muito baixas. Como tal, conclui-se que a velocidade de transferência electrónica intermolecular é muito mais lenta quando o parceiro redox do cit. cd1 não é o cit. c552. Apesar de não se ter conseguido determinar a estrutura cristalina da proteína em estudo no decurso desta tese, concluiu-se por modelação computacional, que esta apresenta uma elevada semelhança estrutural com a proteína de Ps. aeruginosa. Através do estudo bioinformático do acoplamento entre os pares enzima/parceiros redox biológicos (cit. c552 e cit. c), não foi possível verificar diferenças nas interacções estabelecidas entre os dois intervenientes, assim como nas distâncias Fe-Fe entre os hemos c de ambos, contrariando os resultados obtidos por electroquímica. Este facto deve-se ao valor de pH a que foram determinadas as estruturas de proteína usadas neste estudo (pH 8,4) não corresponder ao usado nos ensaios electroquímicos (pH 6,3), não foi possível concluir sobre as diferenças de funcionalidade dos complexos cit. cd1 NiR/cit. c552 e cit. cd1 NiR/cit c observadas experimentalmente (sabe-se que a constante de transferência intermolecular baixa drasticamente a partir de pH 7 [2]). Assim, com o estudo de dockings realizado entre os pares enzima/mediadores químicos, apenas se pôde avaliar a posição de interacção energeticamente favorável, não sendo possível distinguir o papel do agente redutor. Palavras-chave: Citocromo cd1 NiR; Citocromo c552; Transferência electrónica intermolecular; Interacção; Parceiro redox.

VII

VIII

ABSTRACT

The cytochrome cd1 NiR (cyt. cd1) catalyzes the reduction of nitrite to nitric oxide in denitrifying bacteria, such as Marinobacter hydrocarbonoclasticus. It is a homodimer protein with 120 kDa; each monomer consists of two domains, the electron transfer (heme c) and the catalytic (heme d1) domain. Previous studies have demonstrated that the enzymatic activity depends on a structural pre-activation triggered by the entry of electrons through the physiological redox partner, cyt. c552 [1]. The results obtained by mediated electrochemistry showed that the rate of enzymatic reaction depends on the nature of the redox partner. The cyt. c552 provides the highest rate the reaction. Indeed, this was the only agent for which reductive catalytic activity was observed under nitrite saturating conditions, according to a mechanism of the type EC’. In situations where cyt. c552 is replaced by a biological (cyt. c horse heart) or chemical mediator (PMS, indigo carmine and phenosafranine) the catalytic response was only observed at very low scan rates. As such, it is concluded that the intermolecular electron transfer rate is much slower when the redox partner of cyt. cd1 is not cyt. c552. Unfortunately it was not possible to determine the crystal structure of cyt. cd1 during this thesis, nevertheless by computer simulation it was found that it has a high structural similarity to the protein from Ps. aeruginosa. Molecular docking simulations between the pairs cyt. cd1 / cyt. c552 or cyt. c did not show differences in the interactions, neither in the Fe-Fe distances between the hemes c of the two partners, which contrasts the results obtained by electrochemistry. The protein structures used in this study were determined at pH 8,4 which does not correspond to the pH used in the electrochemical tests (pH 6.3), therefore it was not possible to conclude about the differences in functionality of the complexes cyt. cd1 NiR / cyt. c552 and cyt. cd1 NiR / cyt. c (it is known that the intermolecular transfer constant lowers drastically above pH 7 [2]). Thus, this docking study only allowed to evaluate if the protein interactions are energetically favorable, and does not enable to distinguish the role of the reducing agent.

Keywords: Cytochrome cd1 NiR; Cytochrome c552; Intermolecular electronic transfer; Interaction; Redox Partner.

IX

X

ÍNDICE AGRADECIMENTOS --------------------------------------------------------------------------------------- V RESUMO

----------------------------------------------------------------------------------------- VII

ABSTRACT

------------------------------------------------------------------------------------------ IX

ÍNDICE

------------------------------------------------------------------------------------------ XI

ÍNDICE DE FIGURAS ------------------------------------------------------------------------------------- XV ÍNDICE DE TABELAS ----------------------------------------------------------------------------------- XXIII ABREVIATURAS ---------------------------------------------------------------------------------------- XXV CAPÍTULO 1 1.1

INTRODUÇÃO ------------------------------------------------------------------------- 1

Ciclo do Azoto ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 1

1.1.1 1.2

Impacto ambiental --------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 Redutases de nitrito ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 4

1.2.1

Redutase de nitrito Citocromo cd1 – Considerações gerais ----------------------------------------------- 5

1.2.2

Citocromos cd1 NiRs – Estruturas Moleculares --------------------------------------------------------------- 7

1.2.3

Citocromos cd1 NiRs – características espectroscópicas --------------------------------------------------- 9

1.2.4

Parceiros redox fisiológicos e biológicos --------------------------------------------------------------------- 10

1.2.5

Mediadores Químicos --------------------------------------------------------------------------------------------- 12

1.3

Transferência electrónica intramolecular e catálise -------------------------------------------------------- 13

1.4

Transferência electrónica intermolecular ---------------------------------------------------------------------- 15

1.5

Objectivos Propostos ------------------------------------------------------------------------------------------------- 18

CAPÍTULO 2 2.1

MÉTODOS EXPERIMENTAIS ------------------------------------------------------ 19

Purificação de Proteínas – Citocromo cd1 e Citocromo c552 ----------------------------------------------- 19 2.1.1.1

Materiais e reagentes -------------------------------------------------------------------------------------- 19

XI

2.1.1.2

Métodos bioquímicos -------------------------------------------------------------------------------------- 20

2.1.1.3

Procedimentos experimentais – purificação citocromo cd1 ------------------------------------- 21

2.1.1.4

Procedimentos experimentais – purificação citocromo c552 ------------------------------------ 25

2.2

Métodos Electroquímicos ------------------------------------------------------------------------------------------- 26 2.2.1.1

Reagentes ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 26

2.2.1.2

Preparação dos eléctrodos ------------------------------------------------------------------------------- 27

2.2.1.3

Voltametria Cíclica ------------------------------------------------------------------------------------------ 27

2.3

Dockings ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 29

2.4

Cristalografia ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 30 2.4.1.1

Materiais e Reagentes ------------------------------------------------------------------------------------- 30

2.4.1.2

Procedimentos experimentais --------------------------------------------------------------------------- 30

CAPÍTULO 3 3.1

RESULTADOS E DISCUSSÃO------------------------------------------------------- 31

Purificação de proteínas --------------------------------------------------------------------------------------------- 31

3.1.1

Purificação aeróbia ------------------------------------------------------------------------------------------------ 31

3.1.2

Purificação anaeróbia --------------------------------------------------------------------------------------------- 35

3.1.3

Purificação citocromo c552---------------------------------------------------------------------------------------- 37

3.2

Determinação da constante de absortividade molar ------------------------------------------------------- 39

3.3

Determinação de parâmetros cinéticos ------------------------------------------------------------------------- 41

3.3.1

Citocromo c552 – Imáxapp e Kmapp ---------------------------------------------------------------------------------- 41

3.3.2

Citocromo c – Imáxapp e Kmapp ------------------------------------------------------------------------------------- 43

3.4

Determinação de constantes de transferência electrónica intermolecular -------------------------- 46

3.4.1

Citocromo c552 – Parceiro fisiológico putativo -------------------------------------------------------------- 46

3.4.2

Citocromo c de coração de cavalo – Parceiro biológico-------------------------------------------------- 48

3.4.3

PMS -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 50

3.4.4

Índigo carmine ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 52

3.4.5

Fenosafranina ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 53

3.5

Interação Enzima/Doador electrónico – Dockings ----------------------------------------------------------- 56

3.5.1

Estrutura tridimensional de cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonaclasticus ------------------------------ 56

3.5.2

Caso de estudo – Pseudomonas aeruginosa ---------------------------------------------------------------- 62

3.5.2.1

Citocromo cd1 NiR de Pseudomonas aeruginosa/citocromo c551 ------------------------------ 62

3.5.2.2

Citocromo cd1 NiR de Pseudomonas aeruginosa/citocromo c coração de cavalo --------- 68

3.5.3

Citocromo cd1 NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus ------------------------------------------- 71

XII

3.5.3.1

Mediadores biológicos------------------------------------------------------------------------------------- 72

3.5.3.2

Mediadores químicos -------------------------------------------------------------------------------------- 80

3.6 3.6.1

Cristalografia ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 85 Obtenção de cristais de citocromo cd1 NiR ------------------------------------------------------------------ 85

CAPÍTULO 4

CONCLUSÕES E TRABALHO FUTURO ------------------------------------------- 87

CAPÍTULO 5

BIBLIOGRAFIA ----------------------------------------------------------------------- 89

XIII

XIV

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.1- Esquema do ciclo biológico do azoto com referência aos processos de manutenção do equilíbrio dos vários compostos azotados na natureza, assim como as componentes biológicas que gerem esses processos. Adaptado de .................................................................. 1 Figura 1.2- Representação esquemática do ciclo biológico do azoto com referência ao número de oxidação do mesmo átomo central (círculos) nos vários compostos, bem como as enzimas que catalisam as reacções apresentadas de redução e oxidação. Destacam-se nesta classe as redutases de nitrato (Nar, Nap e Nas); as redutases de nitrito (Cu NiR, Cit cd1, NirB e Cc NiR) a redutase de óxido nítrico (Nor) e redutase de óxido nitroso (N2OR). Adaptado de [4] ............... 2 Figura 1.3- Estruturas tridimensionais das proteínas pertencentes a classe das redutases do nitrito. Evidência à divisão segundo o critério do produto formado e subdivisão por cofactor. Adaptados de [12] ......................................................................................................................... 4 Figura 1.4- Representação da estrutura tridimensional da proteína cit. cd1 NiR de Ps. aeruginosa (PDB: 1NIR) .................................................................................................................................... 5 Figura 1.5- Estruturas dos grupos prostéticos: A – hemo do tipo c, B – hemo do tipo d1. ........... 6 Figura 1.6- Representação esquemática das interacções estabelecidas entre os grupos prostéticos e os aminoácidos coordenantes do átomo de ferro dos hemos c e d1, estando as proteínas: A e B- oxidada; C e D- reduzida; sendo a proteína proveniente de: A e CP. pantotrophus; B e D- Ps. aeruginosa. ........................................................................................ 7 Figura 1.7- Representação das estruturas tridimensionais de parceiros redox fisiológicos da proteína citocromo cd1 de deferentes microrganismos. A – Citocromo c551 de Ps. aeruginosa, B – Azurina de Ps. aeruginosa, C – Citocromo c de coração de cavalo, D – Citocromo c552 de M. hydrocarbonoclasticus. ............................................................................................................... 10 Figura 1.8- Mecanismo reaccional proposto da actividade catalítica da proteína citocromo cd1 NiR. Propostas duas vias para a libertação da molécula de NO e consequente regeneração de proteína para um novo ciclo catalítico. Adaptado de [16].......................................................... 13 Figura 1.9- Representação esquemática de uma electroquímica mediada à superfície de um eléctrodo para proteínas da classe das redutases de nitrito. Adaptado de [12]. ....................... 16 Figura 1.10- Representação esquemática da reacção de catálise ocorrida à superfície do eléctrodo por electroqímica mediada. A proteína trata-se do cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus, o parceiro redox é o cit. c552, estando estes imobilizados na superfície do eléctrodo, o substrato reacional permeia a matrix de imobiliazação , do meio reacional até à proteína, assim como o produto o faz no sentido opôs. Adaptado de [7, 21] ........................... 16

XV

Figura 2.1- Esquema de purificação das proteínas cit. cd1 NiR e cit. c552 de M. hydrocarbonoclasticus em condições aeróbias. ......................................................................... 22 Figura 2.2- Esquema de purificação em condições de anaerobiose das proteínas cit. cd1 NiR e cit. c552 de M. hydrocarbonoclasticus. .............................................................................................. 24 Figura 3.1- Espectro de UV/Visível da fracção de cit. cd1 NiR após a coluna DE-52, cuja razão de pureza é 0,3; inserção de uma ampliação do espectro, na região dos cdo característicos da proteína. ...................................................................................................................................... 31 Figura 3.2- Cromatograma da eluição do cit. cd1 da coluna Source 15Q, com registo das densidades ópticas a 3 cdo: ___ 280 nm; _ _ _ 410 nm; - - - - 630 nm. ...................................... 32 Figura 3.3- Cromatograma da eluição do cit.cd1 da coluna Superdex 200, com registo das densidades ópticas a 3 cdo: ___ 280 nm; _ _ _ 410 nm; - - - - 630 nm. ...................................... 33 Figura 3.4- Fracções resultantes da purificação de cit. cd1, após a etapa da exclusão molecular. A – espectro de UV/Visível da fracção mais pura (I1 do gel SDS-PAGE) cuja Rp = 1,2; nos dois estados da oxidação: (- - - -) forma oxidada, (___) forma reduzida; e relevância para os máximos de absorção característicos da proteína; B – gel SDS-PAGE das várias fracções purificadas da proteína. ...................................................................................................................................... 34 Figura 3.5- Gel SDS-PAGE das fracções purificadas em cada etapa cromatográfica e um gel corado para hemos da fracção final. M- marcador de pesos moleculares; A- fracção solúvel; Bfracção após DE-52; C- fracção após Source 15Q; D- fracção final (após Superdex 200); Emarcador de pesos moleculares colorido (hemos); F- fracção final corada para hemos (Rp=1,2). ..................................................................................................................................................... 34 Figura 3.6- Cromatograma da eluição do cit.cd1 (segunda banda e de maior intensidade) da coluna DEAE fast flow, com registo da densidade óptica a 280 nm (_____) e referência ao gradiente salino (_ _ _ _). ............................................................................................................ 35 Figura 3.7- Espectro de UV/Visível da fracção de cit. cd1 NiR, após a coluna DEAE fast flow. ... 36 Figura 3.8- Géis SDS-PAGE das fracções purificadas em cada etapa cromatográfica. M- marcador de pesos moleculares; A- fracção solúvel; B- fracção após DEAE- fast flow; C- fracção após Hitrap; D- fracção final (após Superdex 200). ......................................................................................... 36 Figura 3.9- Cromatograma da eluição do cit. c552 na coluna Superdex 75, com registo das densidades ópticas a 280 nm ...................................................................................................... 37 Figura 3.10- Espectro de UV/Visível do cit. c552 nos dois estados da oxidação: (- - - -) forma oxidada, (___) forma reduzida; e relevância para os máximos de absorção característicos da proteína. ...................................................................................................................................... 38 Figura 3.11- Voltamogramas cíclicos da resposta enzimática, com adição de concentrações crescentes de nitrito (0 – 4,9 mM); a velocidade de varrimento constante (20 mV/s); com a XVI

proteína cit. cd1 e o parceiro redox fisiológico, cit. c552 imobilizados com membrana, em diferentes proporções estequiométricas (excesso de parceiro redox). A – proporção de 1:1; B – proporção de 1:2; C – proporção de 1:4. D – traçado das curvas de Michaelis-Menten para as várias proporções estequiométricas: ____ proporção 1:1; - - - - proporção 1:2; _ _ _ proporção 1:4................................................................................................................................................ 42 Figura 3.12- Voltamogramas cíclicos da resposta enzimática, com adição de concentrações crescentes de nitrito (0 – 4,0 mM); a velocidade de varrimento constante (20 mV/s); com a proteína cit. cd1 e o parceiro redox biológico, cit. c, de coração se cavalo imobilizados com membrana, em diferentes proporções estequiométricas (excesso de parceiro redox). A – proporção de 1:1; B – proporção de 1:2; C – proporção de 1:4. D – esboço das curvas de Michaelis- Menten para as várias proporções estequiométricas: ____ proporção 1:1; - - - proporção 1:2; _ _ _ proporção 1:4. ........................................................................................... 44 Figura 3.13- Voltamogramas cíclicos da resposta electroquímica a deferentes velocidades de varrimento (5 a 200 mV/s) com a proteína cit. cd1 e o parceiro redox cit. c552 (70 µM) imobilizados com membrana. A – na ausência de nitrito, B – com excesso de nitrito (6 mM). ...................... 47 Figura 3.14- Representação da relação de dependência entre a intensidade do sinal com a concentração da proteína cit. cd1. A – λ (Icat/I0) em função de 1/v para várias concentrações de proteína, B – relação de dependência do declive da recta em função da concentração de proteína cit. cd1. ......................................................................................................................................... 47 Figura 3.15- Voltamogramas cíclicos da resposta electroquímica a deferentes velocidades de varrimento (5 a 200 mV/s) com a proteína cit. cd1 e o parceiro redox cit. c de coração de cavalo (70 µM) imobilizados com membrana. A – na ausência de nitrito, B – com excesso de nitrito (6 mM). ............................................................................................................................................ 48 Figura 3.16- Voltamogramas cíclicos da resposta electroquímica da proteína cit. cd1 e o parceiro redox cit. c de coração de cavalo (70 µM) imobilizados com membrana. A – a 5 mV/s, B – a 50 mV/s; com os VCs na ausência de nitrito (___), e com saturação de nitrito (_ _ _) ................... 49 Figura 3.17-Voltamogramas cíclicos da resposta electroquímica a deferentes velocidades de varrimento (5 a 200 mV/s) com a proteína cit. cd1 imobilizados com membrana e o mediador redox PMS (70 µM) em solução. A – na ausência de nitrito, B – com saturação de nitrito (6 mM). ..................................................................................................................................................... 50 Figura 3.18- Voltamogramas cíclicos da resposta electroquímica da proteína cit. cd1 imobilizada com membrana e o mediador redox PMS (70 µM), em solução. A – a 5 mV/s, B – a 200 mV/s; com os VCs na ausência de nitrito (___), e com saturação de nitrito (_ _ _).............................. 51 Figura 3.19- Voltamogramas cíclicos da resposta electroquímica a deferentes velocidades de varrimento (5 a 200 mV/s), com a proteína cit. cd1 imobilizada com membrana e o mediador XVII

redox, índigo carmine (70 µM), em solução. A – na ausência de nitrito, B – com saturação de nitrito (6 mM). ............................................................................................................................. 52 Figura 3.20- Voltamogramas cíclicos da resposta electroquímica da proteína cit. cd1 imobilizada com membrana e o mediador redox índigo carmine (70 µM), em solução. A – a 5 mV/s, B – a 200 mV/s; com os VCs na ausência de nitrito (___), e com saturação de nitrito (_ _ _) ................... 53 Figura 3.21 - Voltamogramas cíclicos da resposta electroquímica a deferentes velocidades de varrimento (5 a 200 mV/s), com a proteína cit. cd1 imobilizados com membrana e o mediador redox fenilalanina (70 µM) em solução. A – na ausência de nitrito, B – com saturação de nitrito (6 mM). ........................................................................................................................................ 54 Figura 3.22- Voltamogramas cíclicos da resposta electroquímica da proteína cit. cd1 imobilizada com membrana e o mediador redox fenosafranina (70 µM), em solução. A – a 5 mV/s, B – a 200 mV/s; com os VCs na ausência de nitrito (___), e com saturação de nitrito (_ _ _). .................. 54 Figura 3.23- Alinhamento de sequências de cit. cd1 NiR, dos microrganismos: M. hydrocarbonoclasticus (H8WEU2), Ps aeruginosa (G8A456), Ps. stutzeri (I6WMF2) e P. pantotrophus (P72181). .............................................................................................................. 57 Figura 3.24- Modelos das estruturas tridimensionais de uma das subunidades estruturais (monómero), simulado pelo programa CHPmodels 3.2, para a proteína cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus. A – estrutura proposta do “esqueleto” proteico, B – estrutura ajustada no programa UCSF Chimera 1.6.1. .............................................................................................. 58 Figura 3.25- Sobreposição das estruturas monomérica de cit. cd1 NiR de Ps. aeruginosa (PDB: 1GJQ) a verde, com a estrutura simulada pelo programa CPHmodels 3.2, da mesma proteína mas de M. hydrocarbonoclasticus, a azul. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1. ............................................................................................................................. 59 Figura 3.26- Mapeamento da distribuição de cargas à superfície (potencial coulombiano) da estrutura simulada para: A e B - proteína cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus e C e D proteína cit. cd1 NiR de Ps. aeruginosa; utilizando 4,0 como o valor da constante dielétrica: A e C– totalidade da estrutura, B e D – zoom em torno do hemo c. Vermelho- cargas negativas, branco- cargas neutras e azul- cargas positivas. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1. ............................................................................................................................. 60 Figura 3.27- Mapeamento de superfície da proteína cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus. A – Vista do hemo do tipo c; B – vista superior do hemo do tipo d1; C – vista inferior do hemo do tipo c. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1. ..................................... 61 Figura 3.28- Representação do ranking das 100 interacções mais favoráveis, entre cit. cd1 NiR e o cit. c551, com dois estados de oxidação do parceiro redox, sendo a estrutura oxidada da proteína cit. cd1; e para dois parâmetros de interacção (global score e hidrofóbico). A e B – cit. XVIII

c551na forma oxidada; C e D – cit. c551 na forma reduzida; A e C – representação das interacções hidrofóbica; B e D – representação do global score. As esferas indicam o centro geométrico do parceiro redox, com a graduação de cores verde (menos favorável) a vermelho (mais favorável) energeticamente. ........................................................................................................................ 63 Figura 3.29- Representação do ranking das 100 interacções mais favoráveis do tipo hidrofóbico, entre cit. cd1 NiR (nos diferentes estados de oxidação) e o cit. c551 na sua forma oxidada. Cit. cd1 NiR na sua forma: A – oxidada; B – reduzida com CN; C – reduzida com NO e D – semi-reduzida. As esferas indicam o centro geométrico do parceiro redox, com a graduação de cores verde (menos favorável) a vermelho (mais favorável) energeticamente. ............................................ 64 Figura 3.30- Distribuição na cadeia polipeptídica da cit. cd1 NiR e do cit. c551 de Ps. aeruginosa dos aminoácidos que estabelecem ligações de hidrogénio com o parceiro redox cit. c551 e a proteína, respectivamente. Resultados dos vários dockings do parceiro no estado oxidado e a enzima em diferentes estados de oxidação: A e E- oxidada, B e F- semi-reduzida, C e G- reduzida com CN, e D e H- reduzida com NO. Sendo a cadeia polipeptídica da cit. cd1 NiR representada de A – D; e a cadeia polipeptídica do cit. c551 representada de E – H. Diferenciado o tipo de interacção por cores: Geométrica – azul, Global score – laranja e Hidrofóbico – cinza. ............ 66 Figura 3.31- Representação do mapa de superfície com evidência das regiões que estabelecem pontes de hidrogénio, interagindo com enzima/parceiro redox. As duas proteínas encontram-se nas suas formas oxidadas e o tipo de interacções estabelecidas são hidrofóbicas. A – cit. cd1 NiR; B - cit. c551; C - distribuição de cargas à superfície (potencial coulombiano) da proteína cit. c551 de Ps. aeriginosa, utilizando 4,0 como o valor da constante dielétrica. Vermelho- cargas negativas, branco- cargas neutras e azul- cargas positivas. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1. ............................................................................................................................. 67 Figura 3.32- Representação do ranking das 100 interações do tipo hidrofóbico mais favoráveis entre cit. cd1 NiR (nos diferentes estados de oxidação) e o cit. c de coração de cavalo. Cit. cd1 NiR na sua forma: A – oxidada; B – reduzida com CN; C – reduzida com NO e D – semi-reduzida. As esferas indicam o centro geométrico do parceiro redox, com a graduação de cores verde (menos favorável) a vermelho (mais favorável) energeticamente. ............................................ 69 Figura 3.33- Distribuição, na cadeia polipeptídica da cit. cd1 NiR de Ps. aeruginosa e do cit. c de coração de cavalo, dos aminoácidos que estabelecem ligações de hidrogénio com o parceiro redox cit. c e a proteína, respectivamente. Resultados dos vários dockings do parceiro e a enzima em vários estados de oxidação: A e E- oxidada, B e F- semi-reduzida, C e G- reduzida com CN, e D e H- reduzida com NO. Sendo a cadeia polipeptídica da cit. cd1 NiR representada de A – D; e a cadeia polipeptídica do cit. c de coração de cavalo representada de E – H. Diferenciado o tipo de interacção por cores: Geométrica- azul, Global score- laranja e Hidrofóbico- cinza.................. 70 XIX

Figura 3.34- Representação do mapa de superfície com evidência das regiões que estabelecem pontes de hidrogénio, interagindo com o parceiro redox/ proteína. As duas proteínas encontram-se nas suas formas oxidadas e o tipo de interacções estabelecidas são hidrofóbicas. A – cit. cd1 NiR; B - cit. c de coração de cavalo; C- distribuição de cargas à superfície (potencial coulombiano) da proteína cit. c de coração de cavalo. Vermelho- cargas negativas, brancocargas neutras e azul- cargas positivas. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1............................................................................................................................................. 70 Figura 3.35- Representação do ranking das 100 interações mais favoráveis entre cit. cd1 NiR e o cit. c552, nas suas formas monomérica e dimérica; para três tipos de parâmetros de interacção: global score, hidrofóbico e geométrico. A, C e E – mediador na forma dimérica; B, D e F – mediador na forma monomérica; A e B – representação do global score; C e D – representação das interacções hidrofóbica; E e F – representação das interacções geométricas. As esferas indicam o centro geométrico do parceiro redox, com a graduação de cores verde (menos favorável) a vermelho (mais favorável) energeticamente. ......................................................... 73 Figura 3.36- Distribuição, na cadeia polipeptídica da cit. cd1 NiR de e do cit. c552 ambos provenientes de M. hydrocarbonoclasticus, dos aminoácidos que estabelecem ligações de hidrogénio com o parceiro redox cit. c552 e a proteína, respectivamente. Resultados dos vários dockings do parceiro redox nas suas duas formas estruturais (mono- dimérica): A e C- monómero e B e D- dímero. Sendo a cadeia polipeptídica da cit. cd1 NiR representada em A e B e a cadeia polipeptídica do cit. c552 representada em C e D. Diferenciado o tipo de interacção por cores: Geométrica- azul, Global score- laranja e Hidrofóbico- cinza. .................................................... 75 Figura 3.37- Representação do mapa de superfície com evidência das regiões que estabelecem pontes de hidrogénio, interagindo com o mediador redox/ proteína. O tipo de interacções estabelecido é hidrofóbico. Apresentam-se dois estudos de intaracção entre a proteína e o parceiro redox, este último nas formas monomérica e dimérica. A – coloração dos aa do cit. cd1 NiR que interagem com cit. c552 monomérico; B - coloração dos aa do cit. cd1 NiR que interagem com cit. c552 dimérico; C - coloração dos aa do cit. c552 monomérico que interagem com a enzima; D – mapeamento de superfície do cit. c552 monomérico, com a respectiva distribuição de cargas (constante dieléctrica de 4,0). Vermelho- cargas negativas, branco- cargas neutras e azul- cargas positivas; E - coloração dos aa do cit. c552 dimérico que interagem com a enzima. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1. ................................................................. 75 Figura 3.38- Representação do ranking das 100 interações mais favoráveis entre cit. cd1 NiR e o cit. c de coração de cavalo; apresentando-se os três tipos de parâmetros de interacção: A– representação do global score; B– representação das interacções hidrofóbicas; C– representação das interacções geométricas. As esferas indicam o centro geométrico do parceiro XX

redox, com a graduação de cores verde (menos favorável) a vermelho (mais favorável) energeticamente. ........................................................................................................................ 77 Figura 3.39- Distribuição, na cadeia polipeptídica da cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus e do cit. c de coração de cavalo, dos aminoácidos que estabelecem ligações de hidrogénio com o parceiro redox cit. c e a proteína, respectivamente. A – cadeia polipeptídica da enzima cit. cd1 NiR; e B – cadeia polipeptídica do parceiro redox, cit. c. Diferenciado o tipo de interacção por cores: Geométrica- azul, Global score- laranja e Hidrofóbico- cinza. ......................................... 79 Figura 3.40- Representações do mapa de superfície com evidência das regiões que estabelecem pontes de hidrogénio, interagindo com o parceiro redox/proteína, o tipo de interacções estabelecidas são hidrofóbicas. A – coloração dos aa do cit. cd1 NiR que interagem com cit. c de coração de cavalo; B - coloração dos aa do cit. c que interagem com a enzima; C – Mapeamento de superfície do cit. c, com a respectiva distribuição de cargas (constante dieléctrica de 4). Vermelho- cargas negativas, branco- cargas neutras e azul- cargas positivas. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1. ................................................................. 79 Figura 3.41- Representação das 9 possíveis interacções entre o hemo c da enzima cit. cd1 e o mediador químico, o PMS; inserção dessa região ampliada e definição das 3 locais preferenciais de interacção: A- 5 moléculas com 5,3-5,6 kcal/mol, B- 2 moléculas 5,3 kcal/mol e C- 1 molécula 5,2 kcal/mol. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1. .......................... 81 Figura 3.42- Representação das 9 possíveis interacções entre o hemo c da enzima cit. cd1 e o mediador químico, o índigo carmine; inserção dessa região ampliada e definição das 3 locais preferenciais de interacção: A- 4 moléculas com 5,5-5,2 kcal/mol e B- 5 moléculas 5,2-5,0 kcal/mol. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1. ................................ 81 Figura 3.43- Representação das 9 possíveis interacções entre o hemo c da enzima cit. cd1 e o mediador químico, a fenosafranina; inserção dessa região ampliada e definição das 3 locais preferenciais de interacção: A- 4 moléculas com 5,6-6,8 kcal/mol, B- 2 moléculas 5,4-5,5 kcal/mol e C- 3 moléculas 5,3-5,4 kcal/mol. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1. ............................................................................................................................. 82 Figura 3.44- Representação das 9 possíveis interacções entre o hemo c da enzima cit. cd1 e o mediador químico, o paraquat; inserção dessa região ampliada e definição das 3 locais preferenciais de interacção: A- 5 moléculas, B- 3 moléculas e C- 1 moléculas. ......................... 82 Figura 3.45- Representação dos mediadores químicos distribuídos pela posições de interacção como cit. cd1 (vista da superfície dos hemos c), sendo diferenciados cada um por uma cor: vermelho – PMS; verde – índigo carmine; roxo – fenosafranina; e amarelo – paraquat. Estando cada um presente nas posições: A/A’ – PMS, fenosafranina, paraquat e/ índigo carmine; B – PMS e fenosafranina; C/C’ – PMS, fenosafranana e/ índigo carmine; D-E – paraquat. As posições A/A’ XXI

e as C/C’ são equivalentes entre si, no monómero adjacente. Estruturas realizadas com recurso ao programa Chimera 1.6.1. ....................................................................................................... 83 Figura 3.46- Cristais de cit. cd1 de M. hydrocarbonoclasticus formados a partir dos Inicial screens, com 15 mg/ml de proteína. .......................................................................................... 85 Figura 3.47- Cristais de cit. cd1 de M. hydrocarbonoclasticus formados a partir dos fines screens do Index H6 e do Index D10, com temperatura entre 25-28 ⁰C e 15 mg/ml (126 µM) de proteína., fazendo referência às respectivas condições de cristalização. ................................................... 86

XXII

ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1.1- Valores máximos de absorvância dos espectros de UV/Visível do cit. cd1 nas formas oxidada e reduzida. --------------------------------------------------------------------------------------------------9 Tabela 1.2- Valores máximos de absorvância dos espectros de UV/Visível do citocromo c552 nas suas formas oxidada e reduzida.-------------------------------------------------------------------------------- 12 Tabela 2.1- Mediadores químicos de transferência electrónica utilizados no estudo electroquímico do cit. cd1. --------------------------------------------------------------------------------------- 26 Tabela 3.1- Valores da constante de absortividade molar para a proteína cit. cd1 NiR de vários microrganismos, para a forma oxidada da proteína. Ref. [39] ------------------------------------------ 39 Tabela 3.2-Valores do ε determinado experimentalmente para 3 cdo do monómero da proteína cit. cd1 de M. hydrocarbonoclasticus. ------------------------------------------------------------------------- 40 Tabela 3.3- Valores das constantes cinéticas experimentais da enzima cit cd1 NiR, com o cit. c552 como parceiro redox de transferência electrónica. -------------------------------------------------------- 43 Tabela 3.4- Valores das constantes cinéticas experimentais da enzima cit cd1 NiR com o cit. c de coração de cavalo como parceiro redox de transferência electrónica. ------------------------------- 45 Tabela 3.5- Análise dos resultados dos alinhamentos das sequências proteicas de cit. cd1 de vários microrganismos. ------------------------------------------------------------------------------------------- 57 Tabela 3.6- Combinações de proteína cit. cd1 NiR e parceiro redox, cit. c551, em diferentes estados de oxidação, utilizadas na modelação dos dockings e os respectivos códigos do PDB. ----------- 62 Tabela 3.7- Valores médios das distâncias entre o átomo de Fe do hemo c do parceiro redox, o cit. c551 e o Fe do hemo c da proteína cit. cd1 NiR, de Ps. aeruginosa, dos “top 12" e “top 5”, para os diferentes estados de oxidação a enzima e para as diferentes categorias de interacção. --- 65 Tabela 3.8- Valores médios das distâncias entre o átomo de Fe do hemo c do parceiro redox, o cit. c e o Fe do hemo c da proteína cit. cd1 NiR, de Ps. aeruginosa, dos “top 12" e “top 5”, para os diferentes estados de oxidação a enzima e para as diferentes categorias de interacção. ------- 68 Tabela 3.9- Valores médios das distâncias, do “top 12” e do “top 5”, entre o átomo de Fe do hemo c do mediador, cit. c552 (dímero e monómero) e o Fe do hemo do tipo c da proteína cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus, diferenciando-se várias categorias de interacção. ------------ 74 Tabela 3.10- Valores médios das distâncias do “top 12” e do “top 5” entre átomo de Fe do hemo c do parceiro redox, cit. c de coração de cavalo e o Fe do hemo do tipo c da proteína cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus, diferenciando-se várias categorias de interacção. ----------------- 78 Tabela 3.11- Apresentação dos percursos electrónicos percorridos entre o doador e o hemo c da enzima, passando pelos vários aminoácidos com indicação das energias de acoplamento; para cada um dos mediadores tendo em conta o local de interacção na estrutura do cit. cd1. ------- 84 XXIII

XXIV

ABREVIATURAS [S] 1/v aa. Abs Ala App Arg BCA BiGGER BSA Cdo Cit. c Cit. c551

Concentração de substrato Inverso da velocidade de varrimento Aminoácido Absorvância Alanina Aparente Arginina Ácido biciconínico Biomolecular Complex Generatoin with Global Evaluation and Ranking Albumina de soro bovino Comprimento de onda Citocromo c Citocromo c551

Cit. c552

Citocromo c552

Cit. cd1 Cys E EC EC' EDTA Eo’ EPR F Gln Gly His HPLC

Citocromo cd1 Cisteína Mecanismo electroquímico Mecanismo electroquímico com reação química associada Mecanismo electroquímico com reação química irreversível associada Etilenodiaminatetraacetato de sódio Potencial formal Espectroscopia de ressonância paramagnética electrónica Constante de Faraday Glutamina Glicina Histidina High performance liquid chromatography

Icat Ile

Intensidade da corrente no catalítico Isoleucina

Ip

Intensidade da corrente da constante heterogénea

Ipa

Intensidade da corrente no pico anódico

Ipc K k'

Intensidade da corrente no pico catódico Constante de velocidade de segunda ordem Constante de velocidade de pseudo-primeira ordem

Km Leu Lis M. hydrocarbonoclasticus Med MÊS Met N

Constante de Michaelis Leucina Lisina Marinobacter hydrocarbonoclasticus Mediador 4-morfolimeetanosulfonato de sódio Metionina Número de electrões transferidos XXV

N2OR Nar NHE NiR Nor Ox P. pantotrophus PDB PEG Phe pI PMS Pro Ps. aeruginosa Ps. stutzeri R RCSB Red Ref. Rmsd Rp SDS-PAGE T Thr TMBZ Trp Tyr UV V v0 Val VC Vmáx Vs ΔE Ε Λ

Redutase do óxido nitroso Redutase de nitrato Eléctrodo de referência de hidrogénio Redutase de nitrito Redutase do óxido nítrico Oxidado Paranacoccus pantotrophus Protein Data Bank Polietilenoglicol Fenilalanina Ponto isoeléctrico Fenasina metil sulfato Prolina Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas stutzeri Constante dos gases Research colloboratory for structural bioinformatics Reduzido Referência bibliográfica Root-mean-square deviation Razão de pureza Dodecil-sulfato de sódio Temperatura (K) Trionina 3,3’5,5’-tetrametilbenzidina Triptofano Tirosina Ultravioleta Velocidade de varrimento Velocidade da reacção Valina Voltamograma cíclico Velocidade máxima da reacção Versus Variação de potencial Constante de absortividade molar Razão Icat /Ip

XXVI

Capítulo 1 INTRODUÇÃO 1.1 CICLO DO AZOTO Muitos compostos inorgânicos são constituídos por um elemento central, sendo este imprescindível no crescimento, desenvolvimento e equilíbrio dos organismos vivos. Os ciclos biológicos são, por excelência, a forma de regeneração desses elementos, tornando-se indispensáveis para uma existência equilibrada dos diversos compostos em que o elemento se encontra na Natureza. O azoto é o quinto elemento mais abundante na natureza [3] e um dos componentes essenciais das biomoléculas [4], tornando o seu ciclo num dos conjuntos de processos biológicos mais relevantes na regeneração de um elemento químico. Uma existência equilibrada dos diversos compostos azotados é mantida pelo ciclo biológico do azoto, o qual estabelece uma relação estável entre o azoto mineral e orgânico [5]. Este ciclo é gerido por diversos processos, como a fixação (podendo ser biológica, atmosférica e industrial), a assimilação, a amonificação, a nitrificação e a desnitrificação [1, 3]. A maioria destes processos é gerida biologicamente por diversos microrganismos (Figura 1.1). Figura 1.1- Esquema do ciclo biológico do azoto com referência aos processos de manutenção do equilíbrio dos vários compostos azotados na natureza, assim como as componentes biológicas que gerem esses processos. Adaptado de 1

As reacções que ocorrem no ciclo do azoto dizem respeito às alterações no número de oxidação deste mesmo elemento (Figura 1.2), existindo uma variação entre +V a –III [4]. Assim, as enzimas que catalisam estas reacções são denominadas por oxidorredutases e pertencem à classe EC1, uma vez que promovem transferências electrónicas entre compostos químicos [6], sendo nomeadas pela reacção que catalisam e pelo composto que utilizam como substrato da reacção.

1

http://www.starsandseas.com/SAS%20Ecology/SAS%20chemcycles/cycle_nitrogen.htm, em 25-06-13

1

Na Figura 1.2 apresentam-se as proteínas responsáveis pela manutenção de um dos ramos do ciclo do azoto, a desnitrificação, na qual este átomo central se encontra presente em diversos compostos com alteração do seu número de oxidação.

Figura 1.2- Representação esquemática do ciclo biológico do azoto com referência ao número de oxidação do mesmo átomo central (círculos) nos vários compostos, bem como as enzimas que catalisam as reacções apresentadas de redução e oxidação. Destacam-se nesta classe as redutases de nitrato (Nar, Nap e Nas); as redutases de nitrito (Cu NiR, Cit cd1, NirB e Cc NiR) a redutase de óxido nítrico (Nor) e redutase de óxido nitroso (N2OR). Adaptado de [4]

A desnitrificação é um processo biológico através do qual o nitrato (NO3-) é reduzido a azoto molecular (N2) mediante a passagem por intermediários reacionais, como são os casos do nitrito (NO2-), da amónia (NH4+) e do óxido nítrico (NO). A desnitrificação ocorre na ausência de oxigénio, tratando-se, por conseguinte, de um processo anaeróbio [4, 6]. A ausência de oxigénio é determinante no processo de desnitrificação, pois só nesta condição é que os N-óxidos se tornam em aceitadores favoráveis de electrões [8]; caso contrário, o oxigénio é o aceitador preferencial. Das enzimas responsáveis pelo processo de desnitrificação destacam-se as redutases, as quais se dividem em quatro categorias, mediante o substrato que reduzem, a saber, as redutases de nitrato (Nar), nitrito (NiR), óxido nítrico (Nor) e óxido nitroso (N2OR) [7]. 2

1.1.1

Impacto ambiental

A existência de alguns compostos azotados (nos quais se incluem os nitratos e os nitritos) em excesso na Natureza aumenta a poluição ambiental, bem como a contaminação de vários ecossistemas. Assim, todos os meios que promovam a redução desses compostos são uma maisvalia para a melhoria da qualidade ambiental [4]. O aparecimento de quantidades excessivas de nitratos e nitritos pode dever-se à actividade humana, pela sua utilização abusiva em fertilizantes azotados na agricultura e a nível de aplicações industriais (por exemplo: conservação de alimentos, tintas, etc.); à conversão fotoquímica dos óxidos de azoto formados pela produção de gases, resultantes de vários processos de combustão (tanto industriais como domésticos) [9]. Como todos os compostos existentes em concentrações excessivas, também estes se tornam em contaminantes, sempre que os métodos biológicos de remoção ou conversão sejam pouco eficientes na sua capacidade de resposta. Os nitritos e nitratos provocam, através de infiltrações nos solos, a contaminação dos mesmos e, por conseguinte, dos lençóis freáticos [3]. Ao entrarem na circulação aquática, estes compostos proliferam como contaminantes da fauna e entram na cadeia alimentar, através da sua absorção por peixes e mariscos. Como elemento integrante da cadeia alimentar, também o ser humano será afectado [9]. A ingestão de nitratos pelo ser humano é recorrente, uma vez que estes fazem parte da constituição de grande parte das plantas, sendo estas um dos elementos participantes no ciclo do azoto (Figura 1.1). Já os nitritos são compostos ingeridos a partir de produtos processados, como carnes curadas, peixes ou queijos, pois estes compostos são utilizados nos métodos de conservação de alimentos. No entanto, e tal como no meio ambiente, a sua ingestão só se torna nociva quando em excesso [10]. Os nitritos, quando na corrente sanguínea, podem assumir um papel patológico visto que possuem a capacidade de se coordenar, irreversivelmente, à hemoglobina, oxidando-a a metahemoglobina; nesta última não pode ligar a molécula de oxigénio e proceder ao seu transporte no sangue. Contudo, estas situações apenas ocorrem para concentrações muito elevadas de nitrito [11]. Pelo acima exposto, entende-se a importância de estudar estruturas biológicas que, como no caso particular desta tese, permitam a conversão destes compostos (nitritos e nitratos), noutros com um papel menos nocivos.

3

1.2 REDUTASES DE NITRITO As redutases de nitrito são uma categoria de proteínas que catalisam a redução de nitrito por duas vias distintas, uma é denominada por ammonia forming (produtoras de amónia), originando como produto final da reacção amónia (NH4+); a outra via denomina-se por NO forming (produtoras de óxido nítrico) sendo o produto final da reacção o óxido nítrico (NO) [12]. As duas categorias de redutases de nitrito mencionadas podem também ser subdividas tendo em conta o tipo de cofactor que as caracteriza [12]. Estes dois tipos de divisão individualizam as proteínas em citocromo c NiR, sirohémica NiR, citocromo cd1 NiR (cit. cd1) e centros de cobre NiR, tal como esquematizado na Figura 1.3.

Figura 1.3- Estruturas tridimensionais das proteínas pertencentes a classe das redutases do nitrito. Evidência à divisão segundo o critério do produto formado e subdivisão por cofactor. Adaptados de [12]

As duas reacções de catálise são descritas pela equação 1, no caso de se tratar de uma proteína da categoria de ammonia forming, ou pela equação 2, quando a proteína em questão se trata de uma NO forming [12]. NO2− + 8H+ + 6e− → NH4+ + 2H2O

(Equação 1)

NO2− + 2H+ + 1e − → NO + H2O

(Equação 2)

Como se pode observar, no caso da categoria de ammonia forming, as enzimas permitem a transferência de 6 electrões na conversão de uma molécula de NO2- em NH4+ [8, 9].

4

Pela equação 2 constata-se que as proteínas da categoria de NO forming envolvem, na sua catálise, a transferência de apenas 1 electrão por molécula de nitrito convertida [2, 4, 11]. Estas proteínas, quando na presença de oxigénio, promovem também a catálise deste a molécula de água, reacção na qual se encontra envolvida a transferência de 4 electrões por molécula convertida, tal como se observa na equação 3 [15]. O2 + 4H+ + 4e− → H2O

1.2.1

(Equação 3)

Redutase de nitrito Citocromo cd1 – Considerações gerais

Das diferentes redutases de nitrito apresentadas anteriormente, o presente trabalho debruçou-se apenas sobre o cit. cd1 NiR, que, como já mencionado, se trata de uma proteína NO forming. Esta enzima encontra-se presente em diversas bactérias desnitrificantes, estando referenciado o seu isolamento a partir de Paracoccus desnitrificans, Paracoccus pantotrophus (P. pantotrophus), Alcaligenes faecalis, Pseudomonas stutzeri (Ps. stutzeri), Pseudomonas aeruginosa (Ps. aeruginosa) e Marinobacter hydrocarbonoclasticus (M. hydrocarbonoclasticus) [1, 4, 12, 13], entre outros, estando as estruturas tridimensionais e os mecanismos catalíticos mais caracterizados nos casos da proteína provenientes de Ps. aeruginosa [14, 15] e de P. pantotrophus [16, 17]. A proteína em estudo nesta tese é proveniente da bactéria desnitrificante marinha M. hydrocarbonoclasticus, a qual, após diversos estudos de filogenia se concluiu tratar da única da espécie do género Marinobacter registada. Em algumas fontes bibliográficas consultada, esta bactéria encontra-se referida também como Pseudomonas nautica 617 ou por Marinobacter aquaeolei; contudo, em 2005, chegou-se à conclusão de que todas se tratam à mesma bactéria, M. hydrocarbonoclasticus [18, 19].

Figura 1.4- Representação da estrutura tridimensional da proteína cit. cd1 NiR de Ps. aeruginosa (PDB: 1NIR)

5

A redutase de nitrito cit. cd1 é um homodímero com 60 kDa por subunidade. Alberga na sua estrutura dois domínios distintos, um de transferência electrónica, mais pequeno (cerca de 11 kDa), no qual se encontra acomodado um hemo do tipo c, tratando-se o segundo do domínio catalítico, de maiores dimensões (cerca de 48 kDa), onde se observa a existência de um hemo do tipo d1 (Figura 1.4) [2, 26]. Cada um dos hemos possui uma funcionalidade específica na catálise enzimática. O hemo do tipo c (Figura 1.5- A) liga-se à proteína através de ligações covalentes estabelecidas pelos átomos de enxofre, enquanto no hemo do tipo d1 a interacção é do tipo não covalente.

Figura 1.5- Estruturas dos grupos prostéticos: A – hemo do tipo c, B – hemo do tipo d1.

O hemo do tipo d1 (Figura 1.5- B) é característico desta proteína [13], sendo apenas sintetizado por uma via especializada presente em organismos desnitrificantes [23]. Estruturalmente, este grupo prostético é uma 3,8-dioxo-17acrilato-profirindiona [11, 21], o qual possui um átomo de ferro hexacoordenado. Este átomo altera o seu estado de oxidação mediante a coordenação que apresente. Este tipo de hemo diferencia-se dos demais por possuir dois anéis de pirrolo saturados e dois grupos electropositivos, como são os casos do grupo carbonilo e do grupo carboxilato [1]. Este grupo hémico possui a capacidade de dissociar a ligação da molécula de NO ligada ao átomo de ferro (Fe – NO), o que não ocorre com os hemos do tipo b [16], os mais semelhantes estruturalmente a este cofactor.

6

1.2.2

Citocromos cd1 NiRs – Estruturas Moleculares

Como foi referido anteriormente, o cit. cd1 NiR, proveniente de alguns microrganismos, já se encontra amplamente estudado, como são os casos de Ps. aeruginosa e de P. pantotrophus [1]. Apresentam-se, de seguida, os aspectos mais relevante, quer a nível estrutural, quer a nível mecanístico. No caso da proteína de P. pantotrophus, foi possível verificar que cada uma das suas subunidades proteicas se divide em dois domínios: o mais pequeno (resíduos aa. 1-134) [1] está situado na região do N-terminal [26] e é maioritariamente composto por hélices α, neste domínio encontra-se acomodado o grupo hémico do tipo c, ligado axialmente à His-17 e na posição proximal à His-69 [12, 14], é também conhecido como o domínio de transferência electrónica. O segundo domínio, presente na região do C-terminal, é composto predominantemente por folhas β e trata-se do de maior dimensão (resíduos aa. 135-567) [26]; alberga um hemo do tipo d1, o qual se encontra localizado centralmente na estrutura apoproteica. Para estabilizar este grupo prostético na estrutura da proteína, o átomo de ferro deste liga-se à His-200 do próprio domínio, o catalítico, e com a Tyr-25 do domínio de transferência electrónica (Figura 1.6- A).

Figura 1.6- Representação esquemática das interacções estabelecidas entre os grupos prostéticos e os aminoácidos coordenantes do átomo de ferro dos hemos c e d1, estando as proteínas: A e B- oxidada; C e D- reduzida; sendo a proteína proveniente de: A e C- P. pantotrophus; B e D- Ps. aeruginosa.

7

Para a proteína proveniente de Ps. aeruginosa, e tal como se pode observar na Figura 1.6-B, os aminoácidos que estabelecem interacção entre o grupo prostético do tipo c e a estrutura proteica tratam-se da His-51 na posição proximal e Met-88 na posição axial [1]. Quanto ao grupo hémico do tipo d1, este interage com a His-182 e o ligando axial para este cofactor da proteína trata-se de um ião hidroxilo, mantendo-se na proximidade a Tyr-10, a qual não é estruturalmente equivalente à Tyr-25 de P. pantotrophus [27], ou seja, não se coordena com o hemo d1 como acontece com a Tyr-25. Apesar de algumas diferenças estruturais entre as duas proteínas, as posições relativas dos grupos prostéticos mantém-se semelhante [27]. Como forma de reforçar a estabilidade da estrutura proteica, assim como para manter a união dos dois domínios distintos, estes estabelecem entre si cerca de 20 pontes de hidrogénio, as quais permitem manter uma distância entre os dois grupos prostéticos, dentro de cada subunidade, cerca de 11 Å na proteína de P. pantotrophus e 11,4 Å na proteína de Ps. aeruginosa [14, 20-21]. A nível estrutural, e no que se refere ao estado de oxidação em que se encontra durante o seu ciclo catalítico, o cit. cd1 é muito versátil, isto é, ocorrem alterações conformacionais da estrutura. Aquando da redução da proteína, ocorre uma diminuição da percentagem de folhas β comparativamente à forma oxidada (48% para 35%). Também a estabilidade térmica é influenciada pelo estado de oxidação da proteína, uma vez que esta é mais instável termicamente no seu estado activo, ou seja, reduzido [1]. Existem, ainda, diferenças de estrutura entre estados de oxidação ao nível dos ligandos que se encontram coordenados aos átomos de ferro dos dois hemos. Assim, para a proteína de P. Pantotrophus, a His-17, que se encontra coordenada ao hemo c, é substituída pela Met-106, enquanto a Tyr-25 é descoordenada do hemo d1, passando o hemo a estar pentacoordenado no estado reduzido, permitindo assim a ligação à molécula de nitrito. No caso da proteína de Ps. aeruginosa, a alteração das coordenações axiais nos dois hemos é menos significativa que na situação anterior, visto que apenas o grupo hidroxilo se descoordena (sob a forma de molécula de água), de modo a que, no estado reduzido, o átomo de ferro esteja pentacoordenado [27]. Importa ainda salientar que um loop do domínio que acomoda o hemo c (resíduos de aminoácidos 99-162 na P. pantotrophus e 56-62 na Ps. aeruginosa) se move aquando da redução do hemo d1, o que desencadeia a redução subsequente também do hemo c [27]. A nível de estrutura primária, a proteína de M. hydrocarbonoclasticus possui uma elevada semelhança entre a proteína de P. pantotrophus e de Ps. aeruginosa [13, 16, 23]. 8

1.2.3

Citocromos cd1 NiRs – características espectroscópicas

Uma das formas mais simplificada de caracterizar e/ou identificar uma proteína, assenta na espectroscopia de UV/Visível. Através desta técnica é possível verificar a existência de bandas de absorção a determinados comprimentos de onda (cdo) caracterizadas pelos seus máximos de absorção. Estes são dependentes da composição proteica, bem como dos grupos prostéticos existentes e dos seus respectivos estados de oxidação. A proteína cit. cd1 NiR é caracterizada pela existência de bandas de absorção, na sua forma oxidada, a 409 nm (banda Soret) e a 521 nm (banda β) referentes ao hemo c; o hemo d1 contribui com uma banda a 636 nm (banda α). No seu estado reduzido, as bandas que são registadas ocorrem a 416 nm (banda Soret), a 521 nm (banda β) e a 548/552 nm (split α); verifica-se, assim, um desvio dos máximos da primeira banda e o aparecimento de uma terceira, todas elas referentes ao hemo do tipo c. Para o grupo hémico d1, o máximo da banda α desvia-se para 629 nm e existe o aparecimento de um pequeno ombro da banda γ a 460 nm [28].

Tabela 1.1- Valores máximos de absorvância dos espectros de UV/Visível do cit. cd1 nas formas oxidada e reduzida.

Tipo de Grupo Banda Hémico Banda α Hemo d1 Split α Hemo c Banda β Hemo c Banda γ Banda Soret Hemo c Aminoácidos aromáticos

cdo (nm) Forma oxidada 636 521 409 280

cdo (nm) Forma reduzida 629 548/552 522 460 416 280

O estado de spin do hemo d1 da proteína de Ps. aeruginosa foi avaliado por espectroscopia de EPR (do inglês: Electron paramagnetic resonance; Ressonância Paramagnética Electrónica), através da qual foi possível verificar a influência do estado de oxidação do cit. cd1, bem como corroborar a existência de uma alteração conformacional entre estados de oxidação e a coordenação existente. Assim, verifica-se que, quando a proteína se encontra reduzida, o estado de spin do hemo d1 é high spin enquanto para o estado oxidado da proteína este é low spin [1].

9

1.2.4

Parceiros redox fisiológicos e biológicos

Para o caso da proteína cit. cd1 NiR de Ps. aeruginosa foram propostos dois parceiros redox que promovem a transferência electrónica, sendo considerados como os doadores fisiológicos de electrões: o citocromo c551 e a azurina [13, 16, 25]. Para a mesma proteína de P. pantotrophus, o parceiro redox associado como fisiológico é o monómero de citocromo c550. Já para o cit. cd1 de M. hydrocarbonoclaticus o doador de electrões é a proteína dimérica citocromo c552, a qual é expressa pelo mesmo microrganismo, encontrando-se em elevadas quantidades no periplama [7]. Na Figura 1.7 apresentam-se as estruturas tridimensionais depositadas na base de dados PDB (do inglês: Protein Data Base) dos parceiros redox fisiológicos da proteína cit. cd1 NiR de Ps. aeruginosa e de M. hydrocarbonoclasticus, e um parceiro biológico mas não fisiológico, o citocromo c de coração de cavalo.

Figura 1.7- Representação das estruturas tridimensionais de parceiros redox fisiológicos da proteína citocromo cd1 de deferentes microrganismos. A – Citocromo c551 de Ps. aeruginosa, B – Azurina de Ps. aeruginosa, C – Citocromo c de coração de cavalo, D – Citocromo c552 de M. hydrocarbonoclasticus.

Como mencionado anteriormente, na bactéria Ps. aeruginosa existem duas proteínas que são parceiros redox do cit. cd1; no entanto existe uma maior afinidade para o cit. c551, em detrimento da azurina (Figura 1.7- A e B). Uma das razões pela preferência pelo cit. c551 é o facto das interacções existentes entre a enzima e os parceiros redox diferirem, ou seja, o cit. cd1 e o 10

cit. c551 interactuam através de interacções electroestáticas, enquanto no caso da azurina essas interacções prevê-se que sejam do tipo hidrofóbico [16, 25]. A disponibilidade de parceiros redox na célula não é um passo limitante da reacção pois estas proteínas são expressas no periplasma em quantidades muito superiores ao valor do Km (cerca de 1 mM) para a reacção de catálise [1]. O cit. c551 é uma proteína mono-hémica com cerca de 9 kDa, que possui acomodado na sua estrutura um hemo do tipo c, sendo este o cofactor que, por se encontrar exposto na superfície da proteína, permite a troca de electrões com o cit. cd1 [16, 25]. Esta proteína é maioritariamente composta por resíduos de aminoácidos ácidos, pelo que tem um ponto isoelétrico de 4,7 [13, 26]. O citocromo c552 é uma proteína dimérica proveniente da bactéria M. hydrocabonoclasticus, na qual cada monómero possui uma massa molecular de 11 kDa, acomodando em cada, um grupo hémico de tipo c, sendo este cofactor que doa electrões ao cit. cd1 [31]. No dímero proteico, os dois grupos hémicos encontram-se em posições adjacentes, sendo a distância dos dois átomos de Fe hémicos de cerca de 18,9 Å [7] Esta proteína caracteriza-se por quatro hélices α em cada monómero, que envolvem o hemo, ficando apenas uma parte do cofactor exposta ao solvente. Uma vez que o grupo prostético é do tipo c, este encontra-se ligado covalentemente à proteína, através de duas pontes dissulfureto estabelecidas com as Cys-14 e a Cys-17. O átomo de Fe do hemo encontrase coordenado com a His-18 e a Met-60 [7]. Esta proteína é apresentada como sendo o parceiro redox fisiológico para a proteína cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus; contudo não o é exclusivamente para esta enzima mas também para a N2OR (redutase do óxido nitroso) do mesmo microrganismo [32]. Num espectro de absorção de UV/Visível é possível verificar a existência de bandas características da proteína com a existência de máximos a determinados comprimentos de onda. Para a forma nativa da proteína (oxidada) esta apresenta os máximos de absorção a 412 nm (banda Soret) e a 525 nm (banda β) referentes ao seu hemo c. Aquando da sua redução, estas apresentam desvios da banda Soret para 417 nm, da banda β a 522 nm e surge um máximo de banda a 552 nm referente ao split α [5, 28], sendo este último o cdo que atribui o nome à proteína.

11

Tabela 1.2- Valores máximos de absorvância dos espectros de UV/Visível do citocromo c552 nas suas formas oxidada e reduzida.

Tipo de Banda Split α

Grupo Hémico hemo c

cdo (nm) Forma oxidada -

cdo (nm) Forma reduzida 552

Banda β

hemo c

525

522

Banda Soret

hemo c

412

417

280

280

Proteínas

1.2.5

Mediadores Químicos

A utilização de mediadores químicos percursores de transferência electrónica é uma forma alternativa à utilização de componentes biológicos para o desenvolvimento do mesmo papel reacional in vitro. Através de ensaios desenvolvidos com diversas proteínas, verificou-se que para a grande maioria das situações, este género de elementos químicos promovem as reacções de forma eficiente [34]. No caso do cit. cd1 NiR verificou-se que, aquando da utilização do PMS (do inglês, Phenazinium, 5-methyl sulfate; fenasina metil sulfato) como mediador electrónico, o produto final da reacção é o NO, portanto o produto originado biologicamente [1]. Desde que os compostos utilizados possuam potenciais próximos dos parceiros redox da proteína, estudos indicam que o produto final da reacção seja comum ao fisiológico [1]. No entanto, há situações em que o mediador químico não pode substituir o parceiro redox fisiológico, pois este último tem uma especificidade para a enzima e condiciona as alterações estruturais para a tornar activa.

12

1.3 TRANSFERÊNCIA ELECTRÓNICA INTRAMOLECULAR E CATÁLISE Como referido anteriormente, a redutase de nitrito cit. cd1 possui dois domínios distintos com papéis funcionais próprios, ou seja, o hemo c promove a transferência electrónica, enquanto o hemo d1 promove a catálise de nitrito a óxido nítrico. Para que a reação ocorra é necessário que a proteína se encontre na sua forma activa (reduzida), e como se mencionou anteriormente, neste estado de oxidação o átomo de ferro hémico está pentacoordenado, permitindo, assim, que a molécula de nitrito se ligue à posição deixada livre no hemo d1. Como o cit. cd1 NiR pertence à classe das oxidorredutases, mais especificamente catalisando reacções de redução dos seus substitutos, o mecanismo catalítico tem início com a própria redução da enzima, através de doadores electroactivos, os quais devem interactuar em primeiro lugar. Este passo de transferência electrónica designa-se por transferência electrónica intermolecular. Em geral, admite-se que o cofactor que recebe os electrões externos seja o hemo c, o qual deverá, subsequentemente, “entregá-los” ao hemo d1; neste caso, está-se perante uma transferência electrónica intramolecular, a qual é acompanhada de alterações estruturais essenciais à activação da enzima cit. cd1. Dos dois mecanismos mencionados, a transferência electrónica intramolecular é aquela cujo estudo se encontra mais aprofundado [11, 16, 26], sendo proposto neste trabalho uma abordagem mais específica da etapa da transferência electrónica intermolecular.

Figura 1.8- Mecanismo reaccional proposto da actividade catalítica da proteína citocromo cd1 NiR. Propostas duas vias para a libertação da molécula de NO e consequente regeneração de proteína para um novo ciclo catalítico. Adaptado de [16].

13

Na Figura 1.8 apresenta-se um mecanismo da reacção desenvolvida pela proteína ao longo do seu ciclo de catálise. A transferência electrónica intermolecular trata-se do primeiro passo para se iniciar a actividade catalítica da proteína cit. cd1 NiR; nesta etapa ocorre a transferência de electrões para o cit. cd1, proporcionando a alteração de seu estado de oxidação para a forma reduzida, sendo esta a forma activa. Após a proteína se encontrar na sua forma totalmente reduzida [(c2+)d12+], liga-se uma molécula de NO2- ao hemo d1, na sua forma pentacoordenada. Seguidamente ocorre a protonação do complexo, promovendo a libertação de uma molécula de água [11, 16], levando posteriormente à formação de uma espécie intermediária com uma ligação a um ião nitrosilo [(c2+)d13+- NO], sendo esta primeira etapa relativamente rápida. [1]. O passo seguinte do mecanismo consiste na libertação do ião nitrosilo sob a forma de molécula de NO e, consequentemente, permitindo a regeneração da proteína para um novo ciclo catalítico [16]. Para explicar este processo, encontram propostas, na literatura, duas vias mecanísticas. A primeira via (1) consiste na libertação da molécula de NO e posterior redução do hemo d1, dando origem à espécie [(c3+)d12+] [1]. Seria expectável que este passo fosse limitante para a velocidade da reacção, uma vez que a molécula de NO possui uma elevada afinidade para o átomo de Fe3+ comparativamente ao Fe2+, tal como se observa noutras proteínas hémicas (mioglobina e hemoglobina). Contudo, no caso do hemo do tipo d1 tal não ocorre, sendo esta dissociação muito rápida [16]. Para a total regeneração da proteína na sua forma activa [(c2+)d12+] e, consequentemente, para a realização de um novo ciclo catalítico, é necessário que ocorra a redução do hemo c através da entrada de um novo electrão, do doador [11, 16]. Alternativamente, a segunda via mecanística (2), na qual ocorre primeiramente a oxidação do hemo c, por transferência electrónica para o hemo d1, o qual é re-reduzido [(c3+)d12+- NO] e, seguidamente dá-se a re-redução do hemo c pela entrada de um electrão, permitindo a quebra da ligação d1–NO e a libertação do produto da reacção, o NO, voltando, assim, a proteína ao seu estado totalmente reduzida e pronta para um novo ciclo catalítico [16]. Propõe-se que a via mecanística (2) ocorre preferencialmente em situações em que o meio reacional se encontra rico em NO [1]. Por conseguinte, o papel das proteínas que promovem a redução do cit. cd1 e, consequentemente, a sua activação, é fundamental para a realização do ciclo catalítico, quer este ocorra através das vias (1) ou (2) propostas no mecanismo reaccional descrito no esquema da Figura 1.8 [11, 13, 16]. 14

1.4 TRANSFERÊNCIA ELECTRÓNICA INTERMOLECULAR A transferência electrónica que ocorre entre os dois grupos hémicos (intramolecular) está associada a uma segunda, a qual ocorre entre o hemo c do cit. cd1 e um doador electrónico (intermolecular) [2]. In vivo, a proteína possui o seu doador electrónico denominado por parceiro redox, encontrando-se referenciado na literatura a utilização de mediadores redox (compostos químicos artificiais) que desempenham o papel de doadores de electrões eficientemente [1]. Os mecanismos de transferência electrónica intermolecular não estão totalmente descritos para esta proteína. Sabe-se que para a enzima se encontrar na sua forma activa necessita de estar reduzida, sendo esse o papel do parceiro redox (conversão de [(c3+)d13+] a [(c2+)d12+]), pelo que a utilização de técnicas que avaliam a transferência electrónica se mostram essenciais para a caracterização desta parte do mecanismo enzimático [2]. A electroquímica é uma das técnicas por excelência para a realização desse tipo de estudos. O processo electroquímico propriamente dito corresponde a uma transferência de electrões heterogénea entre a espécie electroactiva e o eléctrodo, tratando-se assim de um mecanismo electroquímico do tipo E. Contudo, se ocorrer uma reacção química associada à transferência electrónica heterogénea, trata-se de um mecanismo do tipo EC (electroquímico e químico). Este último pode, ainda, ser diferenciado em reversível, caso mantenha o equilíbrio de Nernst, e em irreversível, no caso da reacção directa ser dominante (mecanismo EC’) [35]. É, pois, com base neste tipo de mecanismo electroquímico que irá ser estudada a enzima cit. cd1 NiR. Em termos electroquímicos, define-se uma reacção por transferência electrónica mediada quando esta não ocorrer espontaneamente no eléctrodo mas sim com auxílio de uma proteína/elemento químico, ao invés de directa. Em bioelectroquímica, electroquímica mediada é um processo segundo o qual existe a promoção da transferência electrónica entre o eléctrodo e a proteína por acção de um parceiro/mediador redox, sendo este último o responsável pela transferência de electrões para a enzima.

15

As técnicas de electroquímica permitem, assim, detectar a transferência electrónicas ocorridas de e para os grupos redox das proteínas, como são os casos dos grupos hémicos. Na Figura 1.9 apresenta-se um esquema reacional típico para proteínas da classe das redutases de nitrito. Esta reacção ocorre à superfície de um eléctrodo, o qual fornecerá e receberá, posteriormente, os electrões que são transferidos no sistema por acção do doador electrónico, podendo assim registar o fluxo dos mesmos [2].

Figura 1.9- Representação esquemática de uma electroquímica mediada à superfície de um eléctrodo para proteínas da classe das redutases de nitrito. Adaptado de [12].

Pormenorizando, a análise da reacção ocorrida à superfície do eléctrodo, para a proteína cit. cd1 NiR, de M. hydrocarbonoclasticus, com o seu respectivo parceiro redox, o cit. c552, apresenta-se a Figura 1.10. Ambas a proteínas encontram-se imobilizadas na superfície do eléctrodo através de uma matriz de imobilização [12].

Figura 1.10- Representação esquemática da reacção de catálise ocorrida à superfície do eléctrodo por electroqímica mediada. A proteína trata-se do cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus, o parceiro redox é o cit. c552, estando estes imobilizados na superfície do eléctrodo, o substrato reacional permeia a matriz de imobiliazação, do meio reacional até à proteína, assim como o produto o faz no sentido opôs. Adaptado de [7, 21]

O mecanismo da Figura 1.10 pode ser dividido em 3 passos diferentes. O passo 1 é denominado de transferência electrónica heterogénea; neste passo ocorre a transferência de um electrão por parte do eléctrodo para o cit. c552, alterando assim o estado de oxidação deste, de oxidado para reduzido [2]; esta é uma reacção reversível [17, 30]. 16

No passo 2, o cit. c552 -reduzido transfere, por sua vez, um electrão por monómero de cit. cd1, que altera assim o seu estado de oxidação (para reduzido), atingindo a sua forma activa. Este processo trata-se de uma reacção química homogénea e é irreversível [17, 30]. O passo 3, e último do esquema reacional, corresponde a uma recção química homogénea e consiste na conversão do substrato (NO2-) a produto final (NO). Esta última etapa envolve vários mecanismos de transferência intramolecular (ver secção 1.3.) e trata-se de uma reacção rápida [13, 16]. Como forma de determinar a constante de velocidade associada à reacção que ocorre no passo 2, é necessário que a velocidade desta seja descrita por uma equação de pseudoprimeira ordem [13, 16, 30] . Tal implica garantir que a concentração da enzima seja superior à do cit. c552; no entanto não necessita de ser uma concentração física, pois através da reacção do passo 3, com NO2- saturante assegura-se que há uma renovação permanente de cit. cd1 [34] e, uma vez que a o passo 3 é rápido, afirma-se que a enzima está sempre em concentração superior ao parceiro redox. Desta forma, sabe-se que a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem (k’) é dada pela equação 4: k’=k [cit. cd1-ox]

(Equação 4)

sendo k a constante de velocidade de segunda ordem e dependente da concentração da enzima [17, 30]. Para determinar o valor de k’ da reacção é necessário estabelecer uma razão (λ= Icat/Ip) entre a corrente catalítica (Icat) e a corrente de transferência heterogénea de controlo (Ip) em função do inverso da velocidade de varrimento (1/v), segundo a equação 5 [18],

𝑅𝑇

𝜆 = 𝑘 ′ ∗ 𝑛𝐹 ∗ 1/𝑣

(equação 5)

em que R é a constante dos gases, T a temperatura, n o número de electrões trocados e F a constante de Faraday. Na reacção desta enzima, a constante de segunda ordem (k) é referente à transferência eletrónica intermolecular. Conclui-se, assim, que a constante de transferência intermolecular é dada pelo valor da constante de segunda ordem (k).

17

1.5 OBJECTIVOS PROPOSTOS O trabalho experimental que conduziu à elaboração desta tese teve como objectivo fundamental o estudo estrutural e reaccional da enzima cit. cd1 NiR da bactéria desnitrificante marinha, M. hydrocarbonoclasticus. Para tal, propôs-se a utilização de uma série de técnicas de caracterização e de análise de proteínas, complementares entre si. O primeiro ponto proposto foi a purificação de duas proteínas provenientes de M. hydrocarbonoclasticus, o citocromo cd1 NiR e o seu parceiro redox fisiológico, o citocromo c552, em condições de aerobiose e de anaerobiose. A resposta catalítica da enzima foi estudada por voltametria cíclica, permitindo a determinação de parâmetros cinéticos, Imáx e Kmt e análise da interacção do cit. cd1 com os vários parceiros redox, cit. c552 e cit. c de coração de cavalo, avaliando-se, assim, a especificidade da mesma. Propôs-se, através de métodos electroquímicos, determinar as constantes de velocidade de transferência electrónica intermolecular entre a enzima cit. cd1 NiR e diferentes doadores electrónicos: i) fisiológico – cit. c552; ii) biológico e não fisiológico – cit. c, e iii) químicos – PMS, índigo carmine e fenosafranina. Mediante os resultados obtidos pretendeu-se caracterizar a influência dos mesmos na actividade catalítica enzimática. Através de ferramentas computacionais de modelação de estruturas e de dockings, pretendeu-se caracterizar as interacções estabelecidas entre os pares enzima/doador electrónico, em termos energéticos e estruturais. Como forma de melhorar os resultados obtidos, em colaboração com a Universidade de Freiburg, na Alemanha, tentou-se determinar a estrutura cristalina da proteína cit. cd1 NiR, através da técnica de cristalização e difracção por raios X.

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Capítulo 2 MÉTODOS EXPERIMENTAIS Na realização deste trabalho experimental foi utilizado material corrente de laboratório, assim como outros equipamentos que, consoante a sua relevância e características, se passam a descrever. Na pesagem dos reagentes foi utilizada uma balança analítica da Denver Instrumental Company, com limite de detecção de 0,1 mg. Para a determinação do pH das soluções utilizouse um medidor de pH micropH2000, da Crison, equipado com um eléctrodo de pH, modelo 5209, da mesma marca. Para a medição de volumes inferiores a 5 mL, foram utilizadas micropipetas de vários volumes (P10, P20, P200 P1000 e P5000) da VWR- Ergonomic High Performance. Todas as soluções utilizadas foram preparadas com água MilliQ, 18 Ω cm-1 (desionizada) com recurso ao aparelho da marca Simplicity, equipado com resinas da Simpak. Posteriormente, quando necessário, as soluções aquosas foram filtradas com recurso a uma bomba de vácuo e filtros de papel com um cut-off de 0,45 µm, ambos da VWR International.

2.1 PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS – CITOCROMO CD1 E CITOCROMO C552 2.1.1.1

Materiais e reagentes A purificação das proteínas cit. cd1 NiR e cit. c552 efetuou-se em aerobiose e em

anaerobiose. As separações cromatográficas foram efetuados com recurso a um sistema de HPLC AKTA Basic, da GE Biosciences, acoplado a um computador e controlado pelo programa Unicorn 5.11 da GE Healthcare. Utilizaram-se várias colunas cromatográficas, todas elas de 26 mm de diâmetro e de comprimentos diferentes. As resinas utilizadas possuíam dois tipos de propriedades: i) troca aniónica – DE- 52, proveniente da Whatman, DEAE-Fast Flow, fornecida pela GE Healthcare, Source-15Q, da Amersham Biosciences e Hitrap, da GE Healthcare; e ii) resinas de exclusão molecular – Superdex-200 e Superdex 75, adquiridas à GE Healthcare. Na preparação dos tampões foram utilizadas como soluções stock: 1 M de Tris-HCl (a pH 7,6, para a purificação aeróbia; e pH 8,0, para a purificação anaeróbia) feita a partir do Tris(hidroximetil)aminometano (Tris base; C4H11NO3; 121,14 g/mol; pureza de 99,9%) da SigmaAldrich, o ácido clorídrico (HCl; 36,46 g/mol; pureza de 37%) da Riedel-de-Haën; e 2 M NaCl (NaCl; 58,44 g/mol; pureza de 99%), da Panreac, para a realização dos gradientes de força iónica.

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No caso das soluções utilizadas na purificação em condições anaeróbias, foram todas desoxigenadas através de vários ciclos sucessivos de vácuo/azoto (pureza de 99,9%). Como agente redutor, foi utilizado o ditionito de sódio (Na2S2O4; 174,11 g//mol; pureza de 87%) e como agente oxidante, o ferricianeto de potássio (K3[Fe(CN)6] ; 329.24 g/mol; pureza de 99%), ambos da Merck. 2.1.1.2

Métodos bioquímicos

Centrifugação e Ultracentrifugação Os extratos iniciais foram centrifugados e ultra-centrifugados em tubos da Nalgene, nos aparelhos da marca Beckman Coulter, com os modelos Avanti J-26 XPI Centrifuge e Optica LX80 Ultracentrifuge, respectivamente. Para a centrifugação das amostras ao longo do processo de purificação foi utilizada uma centrífuga da Hermle (modelo Z32HK). Concentração e diálise As proteínas foram concentradas num sistema de pressão com ar comprimido, utilizando unidades de concentração com membranas porosas da Sartotius stedium, com um cut-off de 5 kDa para o cit. c552 e 30 e 50 kDa para o cit. cd1 NiR. As diálises foram efectuadas em membranas de diálise da Spectra-por, cujo cut-off era de 3,5 kDa. Electroforese SDS-PAGE As electroforeses em condições desnaturantes (SDS-PAGE) foram corridas em géis de 12,5% em poliacrilamida, preparados a partir de uma solução de acrilamida-bisacrilamida (Merck), na presença de 1% dodecil-sulfato de sódio (SDS; CH3(CH2)11OSO3Na; 288,4 g/mol; pureza 99%). Os marcadores de pesos moleculares eram da marca Fermentas. Como equipamento, foi utilizado um sistema Mini-Protean da BioRad (8 x 7 x 0,75 cm) e uma fonte de tensão da Eletrophoresis power supply. Os ensaios decorreram durante 1h, a 150 V e a 400 mA. No final da separação, os géis de poliacrilamida foram corados com azul brilhante de Coomassie (Merck). Já a coloração para hemos foi feita com recurso a 0.03% TMBZ (3,3’5,5’tetrametilbenzidina, Sigma-Aldrich), preparado em 30% metanol (v/v, Panreac) e 70% tampão acetato pH 5 (v/v, Panreac), durante 30 minutos; seguido de uma encubação, durante 10 minutos com peróxido de hidrogénio (Sigma-Aldrich); a partir do protocolo de Goodhew et al. [36], efectuando a electroforese em condições nativas, isto é, na ausência de SDS e β- mercaptoetanol.

20

Quantificação de proteínas Na quantificação de proteína foram utilizados dois métodos espectrofotométricos: o método de Bradford e o método do ácido bicinconínico (BCA). Para o primeiro foi utilizado o reagente de Bradford (BioRad) e para o segundo o kit comercial da Sigma-Aldrich. O padrão de proteína utilizado nos dois métodos foi a BSA (do inglês, Bovine Serum Albumin; albumina de soro bovina) da Sigma-Aldrich, com uma concentração de 2 mg/ml. Espectroscopia de UV/Visível Para obtenção dos espectros de UV/Visível, assim como para a quantificação de proteína, recorreu-se a um espectrofotómetro do modelo UV-1800, da Shimadzu; as leituras das amostras foram feitas em células de quartzo, no primeiro caso e em células de plástico (da Sarstedt) para o segundo caso, ambas com um percurso óptico de 1 cm.

2.1.1.3

Procedimentos experimentais – purificação citocromo cd1

Condições aeróbias Todas as etapas do processo de purificação em condições de aerobiose encontram-se esquematizadas na Figura 2.1. A proteína cit. cd1 NiR foi purificada a partir de células de M. hydrocarbonoclasticus, as quais foram crescidas num reactor de 300 L na Unité de Fermentation do LCB-CNRS, em Marselha, França, sendo o conteúdo periplasmático libertado através da técnica de esferoplastos [37]: as células foram diluídas em água a uma temperatura aproximada de 4 ⁰C numa proporção de 1:5 (volume de células/volume de água), juntamente com 500 µM de EDTA (etilenodiaminatetraacetado de sódio), incubando sob agitação lenta durante 30 minutos. O extrato resultante foi centrifugado durante 30 minutos, a 6 000 rpm e a 4 ⁰C, permitindo assim o isolamento do extrato solúvel e a rejeição do sedimento. No passo seguinte efectuou-se uma ultracentrifugação a 44 000 rpm, durante 70 minutos, a 4 ⁰C, separando-se novamente o sedimento do sobrenadante; este último foi dialisado, durante 15 horas, numa solução de 10 mM Tris-HCl a pH 7,6. Todo o sistema de purificação, em particular as colunas cromatográficas, foi controlado termicamente por um sistema de recirculação de água, em que a temperatura foi mantida a 4 ⁰C. De seguida, o extracto solúvel foi aplicado numa coluna de troca aniónica, DE- 52, previamente equilibrada com 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. A eluição desta coluna decorreu por acção 21

da gravidade, daí o caudal não permanecer constante, variando entre 6 e 8 ml/min. A primeira proteína a ser eluída foi o cit. c552, juntamente com o tampão de carga/lavagem, pelo que a sua purificação decorreu separadamente após esta coluna. Depois da eluição total do cit. c552 e da lavagem da coluna, iniciou-se o gradiente de NaCl (0 – 600 mM) em 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, sendo o cit. cd1 NiR eluído com uma concentração salina aproximada de 450 mM de NaCl. Esta fracção de proteína foi novamente dialisada, durante 15 horas, numa solução de 10 mM TrisHCl, pH 7,6.

Figura 2.1- Esquema de purificação das proteínas cit. cd1 NiR e cit. c552 de M. hydrocarbonoclasticus em condições aeróbias.

22

A purificação do cit. cd1 prosseguiu através de uma nova cromatografia de troca aniónica, esta mais selectiva, usando uma coluna Source-15Q, equilibrada em 20 mM Tris-HCl, pH 7,6. A eluição da proteína nesta coluna ocorreu com um caudal constante de 2,5 ml/min, iniciando-se a recolha da fracção quando o gradiente atingia 450 mM de NaCl. A concentração salina variou de 0 – 600 mM em NaCl, sendo o tampão 20 mM Tris-HCl, pH 7,6. A fracção de proteína foi, depois, concentrada com as unidades de concentração cujo cut-off era de 30 kDa. Por fim, a última etapa cromatográfica consistiu numa coluna de exclusão molecular, Superdex- 200, equilibrada com 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, a um caudal constante de 2,0 ml/min. Estes dois últimos processos cromatográficos foram controlados pelo detector de UV/Visível, aos comprimentos de onda de 280, 410 e a 636 nm, acoplado ao sistema de HPLC. Finalmente, a selecção das fracções finais foi feita tendo em conta as razões de pureza calculadas pelas razões das absorvâncias aos comprimentos de onda de 410 e 280 nm (Abs410

nm/Abs280 nm)

e as contaminações (se existentes) presentes nas amostras foram

determinadas por observação do gel de SDS-PAGE, sendo depois guardadas a -80 ⁰C.

Condições anaeróbias Na purificação em condições de anaerobiose, as células de M. hydrocarbonoclasticus foram lisadas através da técnica de esferoplastos [37], com uma ligeira alteração ao protocolo original, ou seja, a diluição das células foi feita em tampão 10 mM Tris-HCl a pH 8,0 (ao invés de água), juntamente com 500 µM de EDTA, incubando sob agitação lenta durante 30 minutos. Todo o processo de purificação das proteínas decorreu em condições anaeróbias e o pH dos tampões foi sempre ajustado para 8,0. O esquema de purificação encontra-se apresentado na Figura 2.2. O extrato resultante foi centrifugado a 50 000 xg durante 30 minutos, com a temperatura controlada a 4 ⁰C, sendo depois separado o extrato solúvel do sedimento, descartando-se este último. O extrato solúvel foi aplicado numa coluna de troca aniónica, uma DEAE fast flow, a qual foi previamente equilibrada com 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, decorrendo o processo a um caudal constante de 3,0 ml/min. A primeira proteína a ser eluída, tal como na condição de aerobiose, foi o cit. c552, antes do início do gradiente; aquando da realização deste (0 – 600 mM NaCl, em

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10 mM Tris-HCl, pH 8,0), o cit. cd1 eluiu a uma concentração aproximada de 450 mM NaCl. A amostra colectada foi posteriormente diluída para minimizar o efeito da concentração salina.

Figura 2.2- Esquema de purificação em condições de anaerobiose das proteínas cit. cd1 NiR e cit. c552 de M. hydrocarbonoclasticus.

O passo seguinte foi uma nova coluna de troca aniónica, uma Hitrap, equilibrada com 20 mM Tris-HCl, a pH 8,0. O gradiente feito com o mesmo tampão variou-se a concentração de 0 – 600 mM NaCl, sendo a proteína eluída a 400 mM NaCl. A eluição da proteína decorreu a um 24

caudal de 2,0 ml/min e a fracção colectada foi posteriormente concentrada com unidades de concentração, em condições de anaerobiose, com recurso a pressão, numa membrana com cut off de 50 kDa. O último passo cromatográfico foi uma coluna de exclusão molecular, Superdex-200, equilibrada com 50 mM Tris-HCl, 150 NaCl e eluído o cit. cd1 NiR a um caudal constante de 2,0 ml/min. Todos os perfis cromatográficos foram e registados pelo detector de UV/Visível acoplado ao sistema de HPLC, a um único cdo (280 nm). As fracções finais foram separadas aplicando os mesmos critérios descrito na subsecção anterior.

2.1.1.4

Procedimentos experimentais – purificação citocromo c552 A proteína cit. c552, tal como o cit. cd1 NiR, é expressa nas células de M.

hydrocarbonoclasticus. Assim sendo, inicialmente, a purificação desta decorreu de igual modo ao descrito na secção 2.1.1.3 para a proteína cit. cd1 NiR, até à eluição do cit. c552, que ocorreu após a primeira coluna cromatográfica (DE-52, na condição de aerobiose; DEAE-fast flow, na condição de anaerobiose), antes da iniciação do gradiente salino. A purificação do cit. c552 decorreu em iguais condições nas duas metodologias. Após a primeira coluna, foi purificada em condições de aerobiose. Seguidamente, a amostra eluída foi concentrada em unidades de concentração com membrana porosa, cujo cut-off era de 5 kDa. A purificação desta proteína apenas necessitou de mais uma etapa, a cromatografia de exclusão molecular, numa coluna Superdex-75, com um tampão de 50 mM Tris-HCl, 150 NaCl, a um caudal constante de 2,0 ml/min. A eluição desta proteína foi controlada pelo detector de UV/Visível a um comprimento de onda de 280 nm, acoplado ao sistema de HPLC. A fracção final resultante da proteína foi concentrada em unidades de concentração com membrana de cut off de 5 kDa e guardada a -80 ⁰C.

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2.2 MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS 2.2.1.1

Reagentes Foi utilizado como electrólito suporte a solução tamponizada de 50 mM MES

(4- morfolimeetanosulfonato de sódio; C6H12NNaO4S; 217,22 g/mol, pureza >99%; Sigma Aldrich), a pH 6,5 e a pH 6,3, em 100 mM de cloreto de potássio (KCl; 74,56g/mol; pureza de 99,5%; Merck) e conservados a 4 ⁰C. No estudo da actividade catalítica da proteína, foram utilizadas soluções stock de nitrito de sódio da Merck (NaNO2; 68,98 g/mol; pureza de 99%), nas seguintes concentrações: 1, 10, 100 mM e 1 M. Devido ao equilíbrio entre as espécies NO2- e NO que decorre a pH ácido, estas soluções foram sendo renovadas todos os meses e preparadas a pH ligeiramente básico. Na avaliação da resposta catalítica da proteína foram utilizados compostos químicos como mediadores redox. Estes foram utilizados a partir de soluções stock de 1mM. Os compostos utilizados foram: i) PMS, ii) índigo carmine, iii) fenosafranina e iv) paraquat (também conhecido por viologénio de metilo) todos da Sigma Aldrich e com uma pureza > 98,5%.

Tabela 2.1- Mediadores químicos de transferência electrónica utilizados no estudo electroquímico do cit. cd1.

Mediador redox PMS (Fenazina, 5-metil-, metil sulfato) Índigo carmine (Disódio (2E) -3-oxo-2(3-oxo-5-sulfonato1,3-dihidro-2H-indol-2elideno) -5indolinosulfonato) Fenosafranina (cloreto de 3,7diamino-5fenilfenasina-5-ium) Paraquat (dicloreto de 1,1dimetil-4, 4-bipiridinio)

Massa molecular Fórmula química

Estrutura

E°' (mV) NHE

306,34 g/mol + 80 C14H14N2O4S

466,36 g/mol - 125 C16H8N2Na2O8S2

322,79 g/mol - 255 C18H15ClN4

257,16 g/mol - 440 C12H14Cl2N2

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2.2.1.2

Preparação dos eléctrodos

Limpeza Antes da utilização dos eléctrodos de trabalho, estes foram sujeitos a um rigoroso processo de limpeza. Primeiramente, o eléctrodo foi polido vigorosamente numa camurça húmida com alumina de diferente granulometrias (0,3 μm e 1 μm) da Buehtler. Posteriormente, procedeu-se a uma lavagem com água desionizada, de modo a remover qualquer resíduo de alumina. Numa terceira etapa, o eléctrodo foi levado a um banho de ultra-sons (Brandson 1510), durante cerca de 5 minutos. Finalmente, os eléctrodos foram lavados com etanol diluído em água, numa proporção de 1 (CH3CH2OH):3 (H2O), e abundantemente com água desionizada, sendo secos com ar comprimido. Os eléctrodos auxiliar e de referência foram apenas lavados abundantemente com água desionizada e secos com ar comprimido, no final de cada utilização. Eléctrodo de trabalho - Montagem da membrana de diálise i) Pequenas proteínas de transferência electrónica como parceiros redox: na avaliação da actividade catalítica da enzima cit. cd1 NiR recorreu-se à montagem de uma membrana de diálise (Spectra-por: cut-off 3500) na superfície de um eléctrodo de grafite pirolítica. Sobre um pedaço de membrana suportado num pequeno o-ring, colocou-se uma gota de 6 μl da seguinte mistura de proteína com os dois parceiros redox: cit. c552 e o cit. c de coração de cavalo (utilizaram-se diferentes proporções estequiométricas- 1:1; 1:2; e 1:4). O eléctrodo foi então pressionado contra o-ring, levando ao aprisionamento das duas proteínas. ii) Mediadores químicos: no estudo da resposta catalítica da enzima com recurso a mediadores químicos, foi utilizado um procedimento semelhante ao ocorrido para os parceiros redox de natureza biológica, com a excepção do mediador não ter sido imobilizado na membrana juntamente com a proteína (sendo esta a única imobilizada), ficando antes em solução.

2.2.1.3

Voltametria Cíclica

Todos os ensaios electroquímicos foram efectuados numa célula de vidro de um só compartimento, usando o potenciostato PGSTAT 12 da Autolab (Eco-chimie), ligado a um computador e comandado pelo software NOVA (versão 1.6). Os eléctrodos de referência de

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Ag/AgCl (198 mV vs NHE) e auxiliar de platina eram da Radiometer. Como eléctrodos de trabalho foram utilizados eléctrodos de grafite pirolítica (diâmetro= 4 mm, home-made) modificados. As células electroquímicas foram lavadas com detergente comercial e um escovilhão e, seguidamente, mergulhadas durante 15 horas, numa solução de limpeza de ácido sulfúrico diluído numa proporção de 1 (H2SO4): 3 (H2O). Antes dos ensaios, as células foram passadas abundantemente por água desionizada, seguida de etanol diluído [1 (CH3CH2):3 (H2O)] e mais água desionizada. Por fim, foram secas com ar comprimido. Foi utilizado um único electrólito suporte, 50 mM MES, 100 mM KCl, a dois valores de pH diferente: a pH 6,5 nos ensaios da determinação das constantes cinéticas, e a pH 6,3 nos ensaios para a determinação das constantes de velocidade de transferência electrónica intermolecular. Antecedendo cada ensaio electroquímico, o electrólito suporte (20 ml) foi desarejado por borbulhamento com um fluxo constante de árgon (Ar), durante cerca de 20 minutos, de modo a evitar interferências do oxigénio no ensaio. Na análise da actividade catalítica da proteína, foram adicionados nitritos aos ensaios com recurso a micropipetas, sendo a solução borbulhada entre adições, de forma a se homogeneizar a mesma. A velocidade de varrimento a que decorreram os ensaios electroquímicos foi constante, a 20 mV/s, salvo nas excepções devidamente referidas. Em situação do estudo realizado a várias velocidades de varrimento estas variaram dentro do intervalo 5 a 200 mV/s. As janelas de potencial utilizadas variaram consoante os doadores electrónicos analisados. Para os parceiros redox biológicos (cit. c552 e cit. c) esta variou entre [0,4; -0,3] V; no caso dos mediadores químicos, foram as seguintes: [0,15; -0,32] V para o PMS; [0; -0,6] V para o índigo carmine; e [ 0,2; - 0,8] V para a fenosafranina.

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2.3 DOCKINGS O primeiro passo do estudo das interações estabelecidas entre proteínas e parceiros/mediadores redox foi a obtenção das estruturas tridimensionais dos intervenientes, ou seja, das proteínas nos vários estados de oxidação, bem como dos respectivos parceiros redox, através da base de dados Protein Data Bank (RCSB- PDB). As estruturas químicas dos mediadores químicos foram obtidas através do Pubchem. Uma vez que a estrutura do cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus não foi ainda determinada experimentalmente, foi necessário proceder ao alinhamento da sua sequência primária no algoritmo NCBI blast – protein com o qual foi possível identificar a sequência proteica que maior homologia/semelhança apresentasse e, assim, simular a estrutura tridimensional da proteína cit. cd1 NiR de M. hydrocarbonoclasticus com o programa computacional CPHmodels 3.2, seguido as instruções padrão disponíveis no seu site. As distribuições de carga à superfície (potencial coulombiano) das proteínas foram obtidas com recurso à ferramenta Coulombic Surface Coloring existente no programa computacional UCSF Chimera 1.6, assumindo como 4,0 o valor da constante dieléctrica. A coloração da superfície foi realizada com recurso ao mesmo programa. Para o estudo das interações propriamente ditas recorreu-se ao algoritmo BiGGER (Biomolecular Complex Generation with Global Evaluation and Ranking) através do qual foram simuladas as interacções. Após a selecção das interacções mais favoráveis energética e quimicamente, estas foram analisadas mais pormenorizadamente cada uma delas com recurso ao software PDBePisa. Os resultados finais foram novamente tratados no programa UCSF Chimera 1.6 de modo a facilitar a sua interpretação e análise das soluções apresentadas. Na análise realizada para os mediadores químicos, primeiramente as estruturas químicas foram requeridas na base de dados do Pubchem, sendo depois o estudo de interacção estabelecido com a enzima realizado pelo algoritmo Autodock Vina (incluído no agregador de software PyRx 0.9), do qual foram extraídos e analisados mais pormenorizadamente pelo software HARLEM-molecular modeling program.

29

2.4 CRISTALOGRAFIA 2.4.1.1

Materiais e Reagentes Para a obtenção de cristais da proteína foi necessário a utilização de placas de 24 e 96

poços para a deposição das gotas de proteína, utilizando a técnica de sitting drop. Na observação dos cristais formados foi utilizado um microscópio óptico. Nos ensaios iniciais de cristalização utilizaram-se os kits comerciais: o Index, o Morpheus e o Footprint I-IV. Após estes ensaios, verificou-se que alguns agentes precipitantes se mostraram promissores. Foram feitas soluções de soluções de stock desses agentes, nomeadamente, 50% (p/v) de PEG 3350 (Fluka); 50% (p/v) PEG 5000 (Fluka); tampão 0,5 M MES a diferentes pH (5,8; 6,0; 6,5 e 7,0); e fumarato de sódio (Na2C4H2O4; 160,04 g/mol). 2.4.1.2

Procedimentos experimentais Para a obtenção de cristais da proteína cit. cd1 NiR foi utilizada a técnica de sitting drop,

consistindo na deposição de uma gota de proteína (0,6 µl) de cit. cd1 (126 µM), numa cavidade, rodeada pela mistura de agentes precipitantes, formando-se o cristal através de difusão vapor. A proteína foi utilizada na sua forma reduzida (purificada em condições de anaerobiose) e adicionando um agente redutor, ditionito de sódio (concentração stock 1 mM, volume